16s rDNA鉴定微生物原理.ppt
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16S_rDNA鉴定细菌地方法
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂：培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕：121.1g Tris，加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L，25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌，室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水，充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4，7.6，8.0)〔1L〕：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4，7.6，8.0〕取100ml，0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
16SrDNA 实验原理
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：PCR实验原理即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
16S鉴定细菌的种属
16S rDNA在原核生物中普遍存在。
16 S rDNA的相对分子量大小适中，约1500 bp，便于序列分析。 在16S rRNA分子中， 既含有高度保守的序列区域，又有中度保
守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类
生物亲缘关系的研究。 bp=base pair
图 16S rDNA基因组成（灰色为保守区，绿色为可变区）
16S rDNA基因全长1542 bp，由9个可变区和10个保守区组成。其中保守区反 映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则表明物种间的差异，且变异程度与细 菌的系统发育密切相关。
DNA的提取
挑取单菌落,然后置于装有100 μLPrepMan Ultra的离心管中, 涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机 最大转速离心 3min ，取 10μL 上清液与 490μL ddH2O （即稀 释50 倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。提取的DNA 于-20℃保存。
利用16S rDNA鉴定细菌 的种属
1.什么是 16S rDNA？ 16SrRNA 为原核生物核糖体 RNA 的一个亚基， 16SrDNA 就是编
码该亚基的基因。 原核生物的rRNA含有3种类型：23S、16S、5S rRNA，它们分别
含有2900、1540和120个核苷酸。
2.用16S rDNA进行细菌鉴定的原因
检测：核酸蛋白仪/琼脂糖凝胶电泳
525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3'
试剂使用量（ 20μL体系）
模板DNA （10ng~100ng） 2μL
PCR 反应条件
Taq 酶(5U/μL)
10×Taq Buffer(Mg2+) dNTPs(2.5mM) 引物F(10 μM) 引物R(10 μM) ddH2O
16S鉴定细菌的种属(PPT30页)
10、雨中黄叶树，灯下白头人。。07:17:1207:17:1207:173/4/2021 7:17:12 AM
11、以我独沈久，愧君相见频。。21.3.407:17:1207:17Mar-214-Mar-21
12、故人江海别，几度隔山川。。07:17:1207:17:1207:17Thursday, March 04, 2021
2μL 0.2 μL 2 μL 1 μL 0.5 μL 0.5 μL 13.8 μL
1min30s
判断16Sr DNA序列扩增是否成功:经琼脂糖凝胶电泳在1500 bp附近 出现条带，说明16s rDNA已经扩增成功。
9、静夜四无邻，荒居旧业贫。。21.3.421.3.4Thursday, March 04, 2021
守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类 生物亲缘关系的研究。 bp=base pair
图 16S rDNA基因组成（灰色为保守区，绿色为可变区）
16S rDNA基因全长1542 bp，由9个可变区和10个保守区组成。其中保守区反 映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则表明物种间的差异，且变异程度与细 菌的系统发育密切相关。
14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏L。or2e0m21ip年su3m月d4o日lor星sit期am四et上, c午ons7e时ct1e7tu分r a1d2ip秒is0ci7n:g17e:l1it2. 2F1u.s3c.4e id urna blandit, eleifend nulla ac,
17、空山新雨后，天气晚来秋。。上午7时17分12秒上午7时17分07:17:1221.3.4
9、杨柳散和风，青山澹吾虑。。21.3.421.3.4Thursday, March 04, 2021
16S_rDNA鉴定细菌的方法
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:1。
提取细菌基因组DNA，2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3。
琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6。
BLAST比对获取相似片段.7。
构建系统进化树试剂：1.1 培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
1.2 1M Tris-HCl （pH7。
4, 7。
6, 8.0）（1L）：121。
1g Tris，加浓盐酸约（70ml， 60ml， 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0。
03个单位。
（Tris—HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml0。
1mol/L Tris）溶液与x ml 0。
1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA（pH8.0)(1L）:186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
（配置方法1。
称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中. 2。
加入约800mL的去离子水，充分搅拌。
3。
用NaOH调节pH值值8。
0（约20g NaOH）。
注意:pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4。
加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6。
室温保存。
）1。
4 10×TE Buffer(缓冲液)（pH7.4，7.6,8。
0）（1L)：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris—HCl（pH7.4,7。
6,8。
0）取100ml,0.5M EDTA（pH8。
0)取20ml.高温高压灭菌,室温保存。
16s rdna测序原理
16s rdna测序原理16s rDNA测序是一种用于研究微生物群落结构和功能的重要技术，它可以帮助科研人员了解微生物的多样性和相互关系，对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16s rDNA测序的原理及其在微生物学研究中的应用。
16s rDNA是细菌和古细菌的小亚基RNA基因的一部分，它在所有细菌和古细菌中都存在，并且在细菌的进化过程中具有高度的保守性。
因此，通过对16s rDNA序列进行测序和比对，可以帮助科研人员了解不同微生物的分类和演化关系。
在进行16s rDNA测序时，首先需要从样品中提取微生物的DNA，然后通过PCR扩增得到16s rDNA的片段。
接下来，对PCR产物进行纯化和测序准备，最常用的方法是通过测序仪进行Sanger测序。
随着高通量测序技术的发展，现在也可以使用Illumina、454或Ion Torrent等平台进行高通量测序，大大提高了测序的效率和速度。
得到16s rDNA序列后，接下来的工作就是对序列进行比对和分析。
科研人员可以利用公开数据库中的16s rDNA序列作为参考，通过比对来确定待测序列的分类地位和系统发育关系。
此外，还可以利用一些生物信息学工具对序列进行多样性分析、物种丰度分析等，从而了解微生物群落的结构和功能。
在微生物学研究中，16s rDNA测序被广泛应用于环境微生物群落的研究。
通过对土壤、水体、空气等不同环境中微生物的16s rDNA进行测序和分析，可以揭示微生物的多样性、分布规律以及其对环境的影响。
此外，16s rDNA测序还可以用于研究人体内的微生物群落，例如肠道菌群的研究，有助于了解微生物与宿主健康的关系。
总之，16s rDNA测序是一种重要的技术手段，它为科研人员提供了解微生物多样性、分类和系统发育关系的重要途径，对微生物学、生态学和生物医学研究具有重要意义。
随着测序技术的不断发展和完善，相信16s rDNA测序在微生物学研究中的应用将会更加广泛和深入。
16S_rDNA鉴定细菌地方法
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂：培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕：121.1g Tris，加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L，25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌，室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水，充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4，7.6，8.0)〔1L〕：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4，7.6，8.0〕取100ml，0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
16S鉴定细菌的种属精品PPT课件
5
特异引物扩增１６ＳｒDNA序列：这个过程一般先用Primer Premier 来设计引物，接下来在利用PCR进行特征序列的扩增。如果是乳酸菌 可以用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1495r： 5′- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。以下是我已Enterococcus KLDS 6.0610的16SrDNA为例设计的引物
验证ＰＣＲ产物 扩增是否成功
选取近似菌种序列 构建系统发育树
与数据库中已知 细菌比较获得样品
种属信息
ＤＮＡ测序获得 １６ＳｒＤＮＡ序列
4
1.弃尽培养液，向培养皿中加入650 μl的Solution A，室温静置1分钟。 2. 用移液枪的取650 μl的细胞悬浮液转移至Collection Tube中。 3.加入0.8 μl的RNase A1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。 4. 弃去上层有机相，再加入1 ml的4℃预冷的Solution C充分混匀后12,000 rpm离心2分钟 5. 弃去上层有机相，然后将水相溶液转移至置于Collection Tube上的Filter Cup中 6. 弃Filter Cup，在滤液中加入400 μl的DB Buffer，混合均匀。 7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作6混合溶液转移至 Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 8. 将500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 9. 将700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 10. 重复操作步骤9。 11. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入 50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 12. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
特异引物扩增１６ＳｒDNA序列：这个过程一般先用Primer Premier 来设计引物，接下来在利用PCR进行特征序列的扩增。如果是乳酸菌 可以用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1495r： 5′- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。以下是我已Enterococcus KLDS 6.0610的16SrDNA为例设计的引物
验证ＰＣＲ产物 扩增是否成功
选取近似菌种序列 构建系统发育树
与数据库中已知 细菌比较获得样品
种属信息
ＤＮＡ测序获得 １６ＳｒＤＮＡ序列
4
1.弃尽培养液，向培养皿中加入650 μl的Solution A，室温静置1分钟。 2. 用移液枪的取650 μl的细胞悬浮液转移至Collection Tube中。 3.加入0.8 μl的RNase A1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。 4. 弃去上层有机相，再加入1 ml的4℃预冷的Solution C充分混匀后12,000 rpm离心2分钟 5. 弃去上层有机相，然后将水相溶液转移至置于Collection Tube上的Filter Cup中 6. 弃Filter Cup，在滤液中加入400 μl的DB Buffer，混合均匀。 7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作6混合溶液转移至 Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 8. 将500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 9. 将700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 10. 重复操作步骤9。 11. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入 50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 12. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
16S_rDNA鉴定细菌的方法
1.510%SDS（W/V）：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。
1.1细菌基因组DNA提取
基本步骤：
材料准备
破碎细胞或胞膜—内容物释放
核算分离、纯化
沉淀或吸附核酸，并去除杂质
核酸溶解在适量缓冲液或水中
基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪
细菌基因组DNA提取方法综述
细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。
14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。
15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。）
1.21M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。(Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃） 50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。
1.1细菌基因组DNA提取
基本步骤：
材料准备
破碎细胞或胞膜—内容物释放
核算分离、纯化
沉淀或吸附核酸，并去除杂质
核酸溶解在适量缓冲液或水中
基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪
细菌基因组DNA提取方法综述
细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。
14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。
15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。）
1.21M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。(Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃） 50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)
用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法PPT课件
第一，由于16 S rDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对 于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。
第二，16 S rDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个 环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。
8
细菌核心基因（看家基因）
虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别，但是 无论多么小，它们必须包含有所有的信息去允许细菌 去执行多种必要的功能，给予细胞维持内部的代谢平 衡的能力，复制和进化，这三种主要的活细胞的功能 。细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能蛋白，因此 ，它们必须去依赖它们自有的基因产物去执行不要的 功能。
9
1.信息的存储和加工 DNA的代谢：（1）基本的复制功能（2）DNA的修复、限制和 修饰 RNA的代谢 ： （1）基本的转运功能（2） 翻译 （3） RNA的降解 2 蛋白质的加工、折叠、分泌 3 细胞的结构和细胞壁的加工 4 活跃且处于中间的代谢
10
gyrB亚单位蛋白的基因 ，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码 基因。在大多数细菌中，以单拷贝的形式存在细菌基因组的rnpA— rmpH—dnaA—dnaN—recF—gyrB—rnpA基因簇中。编码的是唯一 一种能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶一DNA促旋酶的B亚单位蛋白 GyrB。
常见的几种方法： （1）标记法 （2）吸光度法 （3）荧光强度法等
3
DNA-DNA杂交
核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定 在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌 株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对 放射性强度来确定菌株问的同源性程度。
12
Kasai在对小单孢菌属(Micromonospora)15个有效描述的种和4个亚种的gyrB序 列的研究中，得到了与基于16 S rDNA序列相似的系统发育关系，但种内关系结 果不同。经过与DNA—DNA杂交的比较分析，结果表明：基于gyrB序列的分类 关系更符合DNA—DNA杂交结果。
第二，16 S rDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个 环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。
8
细菌核心基因（看家基因）
虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别，但是 无论多么小，它们必须包含有所有的信息去允许细菌 去执行多种必要的功能，给予细胞维持内部的代谢平 衡的能力，复制和进化，这三种主要的活细胞的功能 。细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能蛋白，因此 ，它们必须去依赖它们自有的基因产物去执行不要的 功能。
9
1.信息的存储和加工 DNA的代谢：（1）基本的复制功能（2）DNA的修复、限制和 修饰 RNA的代谢 ： （1）基本的转运功能（2） 翻译 （3） RNA的降解 2 蛋白质的加工、折叠、分泌 3 细胞的结构和细胞壁的加工 4 活跃且处于中间的代谢
10
gyrB亚单位蛋白的基因 ，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码 基因。在大多数细菌中，以单拷贝的形式存在细菌基因组的rnpA— rmpH—dnaA—dnaN—recF—gyrB—rnpA基因簇中。编码的是唯一 一种能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶一DNA促旋酶的B亚单位蛋白 GyrB。
常见的几种方法： （1）标记法 （2）吸光度法 （3）荧光强度法等
3
DNA-DNA杂交
核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定 在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌 株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对 放射性强度来确定菌株问的同源性程度。
12
Kasai在对小单孢菌属(Micromonospora)15个有效描述的种和4个亚种的gyrB序 列的研究中，得到了与基于16 S rDNA序列相似的系统发育关系，但种内关系结 果不同。经过与DNA—DNA杂交的比较分析，结果表明：基于gyrB序列的分类 关系更符合DNA—DNA杂交结果。
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作用：科学家认为这些跨物种的相似性 证明了某个特殊的基因完成了一些许多 生命形式所必须的基本功能，因此在进 化过程中保留了这些序列。 保守序列区域反映了生物物种间的亲缘 关系，16S rDNA分子的序列特征为不同 分类级别的近缘种系统分类奠定了分子 生物学基础。
鉴定原理
高变区
细菌16S核糖体RNA（rRNA） 基因含有9个“高变区”（V1-V9 ），其在不同细菌中表现出相当 大的序列多样性。没有一个区域 可以区分所有细菌;因此，需要进 行系统研究，比较每个区域对特 定诊断目标的相对优势。
小的扩增子大小可能是优选的
（核苷酸986-1043）尽管V6区域长度仅为58bp，但它显示出相当大的序
V6
列可变性，并能够区分大多数细菌物种，V6是用于区分炭疽芽孢杆菌和
蜡状芽孢杆菌的测定的最佳靶区域。
V4、5 、7、8
（核苷酸576-682,822-879,1117-1173和1243-1294）这四个高变区，特 别是V5，由于与其他高变区相比具有更高程度的序列保守性，因此不太 适合物种鉴定。这可能导致灵敏度较低的测定，因为针对该区域设计的 特异性探针可能不会与所有扩增的靶标结合。
微生物鉴定原理
汇报人：王伟
目录
CONTENTS
STEP
STEP
STEP
STEP
01 02 03 04
微生物鉴定 原理
微生物定义、 分类
16s rDNA鉴 定细菌原理
ITS鉴定真菌 原理
0 1 微生物鉴定原理
微生物鉴定原理
通过DNA测序对微生物进行物种 鉴定（菌种鉴定）是比传统生化 鉴定更先进的鉴定方法。DNA测 序不依赖菌种本身特点，对所有 菌种均可使用。比传统生化鉴定 更加快速，准确。
ITS鉴定真菌原理
真核rDNA的基因片段含有18S，5.8S和28S片段，形 成串联重复簇; 5S rDNA分别编码： NTS-非转录间隔区 ，ETS-外转录间隔区，ITS-内部转录间隔区
步骤
包括细菌基因组DNA提取、16srDNA 特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、 DNA测序、序列比对等步骤。
01
鉴定步骤
02
03
PCR扩增
采用细菌 16S rDNA 通用引物对 供试菌株进行 PCR 扩增（聚合酶 链式反应） 。由高温变性、低温 退火（复性）及适温延伸等反应 组成一个周期，循环进行，使目 的DNA得以迅速扩增,具有特异性 强、灵敏度高、操作简便、省时 等特点。
的生物中，在结构与功能上具有高度的保守
性。同时还含有中度保守和高度变化的序列
区域，具有高变性。
可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列
基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物
，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序
列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分
类鉴定。
保守性
鉴定原理
定义：基因的保守型指的是某一段序 列在进化演变的过程中，在不同的物 种都都一直保留。
定义
分类
0 3 16s rDNA鉴定细菌原理
16s rDNA鉴定细菌原理
13030％%
16s rDNA简介
6160％0%
鉴定原理
100％%
鉴定步骤
定义：
16srDNA（16SrRNA为核糖体的RNA 的一个亚基16SrDNA就是编码该亚基的 基因。）鉴定是指用利用细菌16srDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
球菌。V2似乎也是区分分枝杆菌属的最佳靶标。V2具有100bp的平均长
度，这是DNA探针的相对大的靶区域。
（核苷酸433-497）V3在区分细菌和属的水平方面与V2类似。V3比V2短
V3
（65个核苷酸对106个核苷酸），并且用对侧翼序列特异的通用引物的
V3的PCR扩增将导致与V2相比更小的扩增子。在一些实时PCR测定中，较
0 2 微生物定义、分类
微生物是个体难以用肉眼观察的 一切微小生物的统称。
微生物定义、分类
微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一 些小型的原生生物、显微藻类等在内的 一大类生物群体，它个体微小，与人类 关系密切。
微生物划分为以下8大类：细菌、病毒 、真菌、放线菌、立克次体、支原体、 衣原体、螺旋体。有些微生物是肉眼可 以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等 。还有微生物是一类由核酸和蛋白质等 少数几种成分组成的“非细胞生物”， 但是它的生存必须依赖于活细胞。
鉴定 原理
鉴定原理
原因
什 么 原 因 使 得 各 学 者 和 分 类 学 家 使 用 16s rDNA鉴定细菌？
保守性
16s rDNA保守性定义是什么？有什么作用？
高变区
什么叫高变区？怎么样通过高变区鉴定种属关 系，种间关系？
鉴定原理
原因
16srDNA由于其种类少，含量大(约占细菌
RNA含量的80%)，分子大小适中，存在于所有
各区域序列差异性
鉴定原理
（核苷酸69-99）V1区域可用于区分常见的致病性链球菌sp。并区分金
V1
黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌（CONS）物种。这个短序列是设
计金黄色葡萄球菌特异性探针的理想选择。
（核苷酸137-242）V2区域可以将细菌物种区分为属种水平。该区域还
V2
能够区分常见的葡萄球菌和链球菌病原体以及梭菌，嗜血杆菌和奈瑟氏
0 4 ITS鉴定真菌原理
原理：
内转录间隔区ITS由于不需要加入成 熟核糖体，因此在进化过程中能够承受更 多的变异，属于中度保守的区域， 其保 守性基本上表现为种内相对一致,种间差 异比较明显。这种特点使ITS适合于真菌 物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差 异较明显的菌群间的系统发育关系分析。 利用它可研究种及种以下的分类阶元。
16srDNA是细菌染色体上编码 16srRNA相对应的DNA序列，存在于所 有
02
16S rRNA与16S rDNA的区别
16S中的"S"是一个沉降系数，亦即反映生 物大分子在离心场中向下沉降速度的一个 指标，值越高，说明分子越大。 rDNA 和 rRNA中的小写字母"r"是ribosome(核糖体) 的缩写。 rDNA指的是基因组中编码核糖体 RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列，也 就是编码16S rRNA的基因。 rRNA指的是 rDNA的转录产物，它是构成核糖体的重要 成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而 成，16S rRNA是其中一个组件. 一般所分析 的对象都是16s rDNA，因为DNA提取容易， 也比较稳定。。
鉴定原理
高变区
细菌16S核糖体RNA（rRNA） 基因含有9个“高变区”（V1-V9 ），其在不同细菌中表现出相当 大的序列多样性。没有一个区域 可以区分所有细菌;因此，需要进 行系统研究，比较每个区域对特 定诊断目标的相对优势。
小的扩增子大小可能是优选的
（核苷酸986-1043）尽管V6区域长度仅为58bp，但它显示出相当大的序
V6
列可变性，并能够区分大多数细菌物种，V6是用于区分炭疽芽孢杆菌和
蜡状芽孢杆菌的测定的最佳靶区域。
V4、5 、7、8
（核苷酸576-682,822-879,1117-1173和1243-1294）这四个高变区，特 别是V5，由于与其他高变区相比具有更高程度的序列保守性，因此不太 适合物种鉴定。这可能导致灵敏度较低的测定，因为针对该区域设计的 特异性探针可能不会与所有扩增的靶标结合。
微生物鉴定原理
汇报人：王伟
目录
CONTENTS
STEP
STEP
STEP
STEP
01 02 03 04
微生物鉴定 原理
微生物定义、 分类
16s rDNA鉴 定细菌原理
ITS鉴定真菌 原理
0 1 微生物鉴定原理
微生物鉴定原理
通过DNA测序对微生物进行物种 鉴定（菌种鉴定）是比传统生化 鉴定更先进的鉴定方法。DNA测 序不依赖菌种本身特点，对所有 菌种均可使用。比传统生化鉴定 更加快速，准确。
ITS鉴定真菌原理
真核rDNA的基因片段含有18S，5.8S和28S片段，形 成串联重复簇; 5S rDNA分别编码： NTS-非转录间隔区 ，ETS-外转录间隔区，ITS-内部转录间隔区
步骤
包括细菌基因组DNA提取、16srDNA 特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、 DNA测序、序列比对等步骤。
01
鉴定步骤
02
03
PCR扩增
采用细菌 16S rDNA 通用引物对 供试菌株进行 PCR 扩增（聚合酶 链式反应） 。由高温变性、低温 退火（复性）及适温延伸等反应 组成一个周期，循环进行，使目 的DNA得以迅速扩增,具有特异性 强、灵敏度高、操作简便、省时 等特点。
的生物中，在结构与功能上具有高度的保守
性。同时还含有中度保守和高度变化的序列
区域，具有高变性。
可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列
基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物
，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序
列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分
类鉴定。
保守性
鉴定原理
定义：基因的保守型指的是某一段序 列在进化演变的过程中，在不同的物 种都都一直保留。
定义
分类
0 3 16s rDNA鉴定细菌原理
16s rDNA鉴定细菌原理
13030％%
16s rDNA简介
6160％0%
鉴定原理
100％%
鉴定步骤
定义：
16srDNA（16SrRNA为核糖体的RNA 的一个亚基16SrDNA就是编码该亚基的 基因。）鉴定是指用利用细菌16srDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
球菌。V2似乎也是区分分枝杆菌属的最佳靶标。V2具有100bp的平均长
度，这是DNA探针的相对大的靶区域。
（核苷酸433-497）V3在区分细菌和属的水平方面与V2类似。V3比V2短
V3
（65个核苷酸对106个核苷酸），并且用对侧翼序列特异的通用引物的
V3的PCR扩增将导致与V2相比更小的扩增子。在一些实时PCR测定中，较
0 2 微生物定义、分类
微生物是个体难以用肉眼观察的 一切微小生物的统称。
微生物定义、分类
微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一 些小型的原生生物、显微藻类等在内的 一大类生物群体，它个体微小，与人类 关系密切。
微生物划分为以下8大类：细菌、病毒 、真菌、放线菌、立克次体、支原体、 衣原体、螺旋体。有些微生物是肉眼可 以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等 。还有微生物是一类由核酸和蛋白质等 少数几种成分组成的“非细胞生物”， 但是它的生存必须依赖于活细胞。
鉴定 原理
鉴定原理
原因
什 么 原 因 使 得 各 学 者 和 分 类 学 家 使 用 16s rDNA鉴定细菌？
保守性
16s rDNA保守性定义是什么？有什么作用？
高变区
什么叫高变区？怎么样通过高变区鉴定种属关 系，种间关系？
鉴定原理
原因
16srDNA由于其种类少，含量大(约占细菌
RNA含量的80%)，分子大小适中，存在于所有
各区域序列差异性
鉴定原理
（核苷酸69-99）V1区域可用于区分常见的致病性链球菌sp。并区分金
V1
黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌（CONS）物种。这个短序列是设
计金黄色葡萄球菌特异性探针的理想选择。
（核苷酸137-242）V2区域可以将细菌物种区分为属种水平。该区域还
V2
能够区分常见的葡萄球菌和链球菌病原体以及梭菌，嗜血杆菌和奈瑟氏
0 4 ITS鉴定真菌原理
原理：
内转录间隔区ITS由于不需要加入成 熟核糖体，因此在进化过程中能够承受更 多的变异，属于中度保守的区域， 其保 守性基本上表现为种内相对一致,种间差 异比较明显。这种特点使ITS适合于真菌 物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差 异较明显的菌群间的系统发育关系分析。 利用它可研究种及种以下的分类阶元。
16srDNA是细菌染色体上编码 16srRNA相对应的DNA序列，存在于所 有
02
16S rRNA与16S rDNA的区别
16S中的"S"是一个沉降系数，亦即反映生 物大分子在离心场中向下沉降速度的一个 指标，值越高，说明分子越大。 rDNA 和 rRNA中的小写字母"r"是ribosome(核糖体) 的缩写。 rDNA指的是基因组中编码核糖体 RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列，也 就是编码16S rRNA的基因。 rRNA指的是 rDNA的转录产物，它是构成核糖体的重要 成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而 成，16S rRNA是其中一个组件. 一般所分析 的对象都是16s rDNA，因为DNA提取容易， 也比较稳定。。