16s rDNA鉴定微生物原理.ppt
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16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增,电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂:培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕:121.1g Tris,加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L,25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后,加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕:186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌,室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O,置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水,充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意:pH值至8.0时,EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4,7.6,8.0)〔1L〕:组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4,7.6,8.0〕取100ml,0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌,室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕:称10gSDS,68℃加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析,但核苷酸太少,仅几十bp,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍,分子量太大,分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右,较为适合PCR 扩增,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA,但是要直接将16SrRNA提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase降解,因而利用16S rDNA鉴定细菌,其技术路线如下:PCR实验原理即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker,溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE(pH 8.0)三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中,180 r/min,37 ℃培养过夜,按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:1。
提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增,电泳检测纯度与大小。
3。
琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6。
BLAST比对获取相似片段.7。
构建系统进化树试剂:1.1 培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
)。
1.2 1M Tris-HCl (pH7。
4, 7。
6, 8.0)(1L):121。
1g Tris,加浓盐酸约(70ml, 60ml, 42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。
冷却到室温后调pH,每升高1℃,pH大约下降0。
03个单位。
(Tris—HCl缓冲液(0.05mol/L,25℃)50ml0。
1mol/L Tris)溶液与x ml 0。
1mol/L 盐酸混匀后,加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA(pH8.0)(1L):186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。
(配置方法1。
称取186.1g Na2EDTA•2H2O,置于1L烧杯中. 2。
加入约800mL的去离子水,充分搅拌。
3。
用NaOH调节pH值值8。
0(约20g NaOH)。
注意:pH值至8.0时,EDTA才能溶解。
4。
加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。
6。
室温保存。
)1。
4 10×TE Buffer(缓冲液)(pH7.4,7.6,8。
0)(1L):组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。
1M Tris—HCl(pH7.4,7。
6,8。
0)取100ml,0.5M EDTA(pH8。
0)取20ml.高温高压灭菌,室温保存。
16s rdna测序原理16s rDNA测序是一种用于研究微生物群落结构和功能的重要技术,它可以帮助科研人员了解微生物的多样性和相互关系,对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16s rDNA测序的原理及其在微生物学研究中的应用。
16s rDNA是细菌和古细菌的小亚基RNA基因的一部分,它在所有细菌和古细菌中都存在,并且在细菌的进化过程中具有高度的保守性。
因此,通过对16s rDNA序列进行测序和比对,可以帮助科研人员了解不同微生物的分类和演化关系。
在进行16s rDNA测序时,首先需要从样品中提取微生物的DNA,然后通过PCR扩增得到16s rDNA的片段。
接下来,对PCR产物进行纯化和测序准备,最常用的方法是通过测序仪进行Sanger测序。
随着高通量测序技术的发展,现在也可以使用Illumina、454或Ion Torrent等平台进行高通量测序,大大提高了测序的效率和速度。
得到16s rDNA序列后,接下来的工作就是对序列进行比对和分析。
科研人员可以利用公开数据库中的16s rDNA序列作为参考,通过比对来确定待测序列的分类地位和系统发育关系。
此外,还可以利用一些生物信息学工具对序列进行多样性分析、物种丰度分析等,从而了解微生物群落的结构和功能。
在微生物学研究中,16s rDNA测序被广泛应用于环境微生物群落的研究。
通过对土壤、水体、空气等不同环境中微生物的16s rDNA进行测序和分析,可以揭示微生物的多样性、分布规律以及其对环境的影响。
此外,16s rDNA测序还可以用于研究人体内的微生物群落,例如肠道菌群的研究,有助于了解微生物与宿主健康的关系。
总之,16s rDNA测序是一种重要的技术手段,它为科研人员提供了解微生物多样性、分类和系统发育关系的重要途径,对微生物学、生态学和生物医学研究具有重要意义。
随着测序技术的不断发展和完善,相信16s rDNA测序在微生物学研究中的应用将会更加广泛和深入。
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增,电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂:培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕:121.1g Tris,加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L,25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后,加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕:186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌,室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O,置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水,充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意:pH值至8.0时,EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4,7.6,8.0)〔1L〕:组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4,7.6,8.0〕取100ml,0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌,室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕:称10gSDS,68℃加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。
16s rdna测序原理16S rDNA测序是一种基于16S rRNA基因的测序方法,该方法用于研究微生物的多样性和进化关系。
16S rRNA基因存在于所有细菌和古细菌的基因组中,它具有高度保守的序列区域和变异的序列区域,可以作为鉴定和分类微生物的分子标记。
16S rDNA测序的原理是通过PCR扩增目标DNA片段,然后将扩增的DNA片段纯化,接着进行测序。
一般来说,测序过程包括DNA提取、PCR扩增、测序反应、分析和比对等步骤。
首先,在样品中提取出微生物的总DNA,包括细胞外和细胞内的DNA。
提取方法根据样品的类型和要求的纯度进行选择,常用的是酚-氯仿法或商业DNA提取试剂盒。
然后,选择适当的引物对16S rDNA进行PCR扩增。
引物的选择需要考虑到引物的特异性和适用范围,常用的引物是通用的16S rDNA引物,例如27F和1492R。
PCR扩增可以通过热循环法进行,其中包括一系列的加热、退火和延伸步骤。
接下来,对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化处理,去除PCR反应中的引物和杂质,以获得纯净的目标DNA片段。
纯化方法可以使用商业的DNA纯化试剂盒或凝胶纯化等。
然后,对纯化后的DNA片段进行测序反应,通常使用链终止法(Sanger测序)或高通量测序技术(如Illumina MiSeq或Ion Torrent)进行。
测序反应产生的测序片段将通过鉴定碱基的荧光信号或电信号来确定碱基的顺序。
最后,通过分析软件对测序结果进行分析和比对,将测序片段与已知的16S rDNA序列数据库进行比对,以识别样品中存在的微生物并进行分类和系统发育分析。
常用的分析软件包括QIIME、Mothur和MEGAN等。
16S rDNA测序方法已成为研究微生物多样性和进化关系的重要工具,其原理简单且经济高效,可以在较短的时间内获得大量的序列数据,为深入了解微生物的生态学、进化和功能研究提供了有效的手段。
16s rdna测序原理
16s rDNA测序原理是基于微生物的基因组学研究,它是
一种用于鉴定微生物物种的方法。
它以16s rDNA(核糖体rDNA)序列作为微生物鉴定的基础。
16s rDNA是一种普遍存
在于细菌和古菌核糖体中的核酸,具有一定的特殊序列,它们在不同物种之间有着显著的差异。
16s rDNA测序技术是一种利用这种序列息分析样本中微
生物组成的高通量分析技术。
它可以准确地检测到各种微生物,从而实现对样本中微生物的识别和定性分析。
细菌和古菌的16s rDNA测序可以从样品中提取16S
rDNA序列的基因序列,再利用PCR(聚合酶链反应)技术对16S rDNA序列进行扩增,然后再用测序仪对扩增的16S
rDNA序列进行测序,最后再利用计算机分析软件对测序结果
进行分析,从而得到样品中微生物的物种组成。
16s rDNA测序技术在微生物鉴定中非常重要,它是一种
快速、简便、高灵敏的方法,能够准确地识别出样品中的微生物,而不需要进行其他复杂的分析步骤,极大地提高了微生物鉴定的效率和准确性,可以用于环境监测、食品安全检测、医学检测等方面。
16s rDNA测序技术同时也可以用于微生物群落的多样性研究,可以检测样品中微生物种群的多样性,以及不同微生物之间的相互作用,为生态学研究提供重要的息。
总之,16s rDNA测序技术是一种灵敏、可靠、准确的微生物鉴定技术,它可以用于微生物的鉴定和多样性研究,为环境监测、食品安全检测、医学检测等方面提供重要的息,发挥着重要的作用。
细菌16SrDNA测序鉴定一、细菌总DNA提取二、16SrDNA的扩增1、以单菌落或菌悬液为模板的16SrDNA扩增体系25ul体系Buffer(含有Mg2+):2.5 uldNTP:2.5 ul:3,-primer:0.5ul5,-primer:0.5ul模板:1个单菌落(或1 ul在LB培养液中37℃,12h的菌悬液)吐温20:2ulTaq酶:0.3水:16.7(或15.7ul)细菌16S rDNA的通用引物为Pf-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和Rf-TACCTTGTTACCACTT许敬亮博士论文66页:扩增采用通用的引物,其正向序列为:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',反向互补序列为: 5'-TTCAGCATTGTTCCAT-3'。
黄婷婷博士论文70页:5’端:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(Escherichia coli bases 8 to 27),3’端:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'(Escherichia coli bases 1507 to 1492)。
2、以总DNA为模板的16SrDNA扩增体系25ul体系Buffer(含有Mg2+):2.5 ul (购买)dNTP:2.5 ul:3,-primer:0.5ul5,-primer:0.5ul模板:1 ulTaq酶:0.3(或0.2ul)双蒸水:17.7(或17.8ul)3、PCR反应条件94℃,5min;95℃,变性30s;50℃~52℃(可根据扩增情况进行适当调节),退火30s;72℃,延伸1min;30个循环;72℃,延伸15min;10℃(or4℃),保温10min(or nh)。
4、检测扩增效果取1~3 ul扩增产物,适量load buffer,以DL2000为Marker,上0.75%琼脂糖凝胶跑电泳(电压挑低些80~100,胶长些,利于各扩增产物分离及回收切胶)注:扩增条件摸索时每个模板只扩1管即可三、16SrDNA的回收扩增出的每一管16SrDNA经0.75%琼脂糖凝胶电泳检测后,将效果好的各管16SrDNA合并使达到60~100ul样量,100ul16SrDNA+10ul溴酚蓝跑电泳回收胶(电泳液需换成新鲜的,DL2000为Marker),EB染色后在紫外灯下切下16SrDNA 条带放入1.5ml离心管中(离心管事先称重),按DNA凝胶回收试剂盒操作说明回收16SrDNA,取回收16SrDNA 2ul(Dl2000为Marker)跑电泳观察浓度(亮度)与纯度(条带数与位置)。
16srdna菌种鉴定原理宝子!今天咱来唠唠16S rDNA菌种鉴定原理,这可超级有趣呢!在微生物这个超级微小又超级神秘的世界里,要想知道一个小细菌到底是啥种类,就像在一个超级大的人群里找到一个人的身份一样难。
不过呢,微生物们有它们自己独特的“身份证”,这个“身份证”就是16S rDNA啦。
16S rDNA是啥呢?它其实是细菌的核糖体RNA(rRNA)的一个亚基的基因序列哦。
你可以把细菌想象成一个小小的工厂,那核糖体就是这个小工厂里生产蛋白质的超级重要的“机器”。
16S rDNA就像是这个“机器”的一部分的设计蓝图,而且这个蓝图在不同种类的细菌里是有区别的呢。
就好比不同品牌的手机,它们内部的一些小零件的设计是不一样的。
16S rDNA在不同细菌里长度大概在1500个碱基对左右,这里面有一些区域是非常保守的,就像手机都有屏幕这个基本的部件一样。
而还有一些区域呢是可变的,就像不同手机品牌的屏幕可能在分辨率、色彩显示等方面有差别。
这些保守区和可变区组合起来,就成了细菌独一无二的特征啦。
那科学家们怎么利用16S rDNA来鉴定菌种呢?他们就像侦探一样哦。
首先得把细菌的16S rDNA这个基因序列从细菌里提取出来。
这就有点像从一个神秘的小盒子里找出特定的小纸条一样。
提取出来之后呢,就要对这个基因序列进行测序啦。
测序就像是把小纸条上的字一个一个读出来,然后记录下来。
得到这个基因序列之后,就可以和数据库里已经知道的各种细菌的16S rDNA序列进行比对啦。
数据库里有超级多不同细菌的“身份证信息”呢。
这就好比是拿着我们刚得到的小纸条,去一个巨大的图书馆里找有没有一样或者相似的纸条。
如果找到很相似的,那就可以大概率判断这个细菌是属于哪一类啦。
而且呀,16S rDNA鉴定菌种有好多优点呢。
它在细菌里广泛存在,几乎所有的细菌都有这个“身份证”。
这就像每个人都有自己的身份证一样普遍。
而且这个方法相对来说比较简单,不需要特别复杂的仪器设备就能做初步的鉴定。
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增,电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂:1.1培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
)。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)(1L):121.1g Tris,加浓盐酸约(70ml, 60ml, 42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。
冷却到室温后调pH,每升高1℃,pH大约下降0.03个单位。
1.3 0.5M EDTA(pH8.0)(1L):186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。
1.4 10×TE Buffer(pH7.4,7.6,8.0)(1L):组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。
1M Tris-HCl (pH7.4,7.6,8.0)取100ml,0.5M EDTA(pH8.0)取20ml。
高温高压灭菌,室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS(W/V):称10g,68℃加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl:称292.2gNaCl,高温高压灭菌,4℃保存。
7、CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7M NaCl):溶解4.1g NaCl,加10g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24:1(V/V)的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。