16s rDNA鉴定微生物原理.ppt
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16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增,电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂:培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕:121.1g Tris,加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L,25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后,加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕:186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌,室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O,置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水,充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意:pH值至8.0时,EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4,7.6,8.0)〔1L〕:组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4,7.6,8.0〕取100ml,0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌,室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕:称10gSDS,68℃加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析,但核苷酸太少,仅几十bp,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍,分子量太大,分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右,较为适合PCR 扩增,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA,但是要直接将16SrRNA提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase降解,因而利用16S rDNA鉴定细菌,其技术路线如下:PCR实验原理即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker,溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE(pH 8.0)三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中,180 r/min,37 ℃培养过夜,按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:1。
提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增,电泳检测纯度与大小。
3。
琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6。
BLAST比对获取相似片段.7。
构建系统进化树试剂:1.1 培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
)。
1.2 1M Tris-HCl (pH7。
4, 7。
6, 8.0)(1L):121。
1g Tris,加浓盐酸约(70ml, 60ml, 42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。
冷却到室温后调pH,每升高1℃,pH大约下降0。
03个单位。
(Tris—HCl缓冲液(0.05mol/L,25℃)50ml0。
1mol/L Tris)溶液与x ml 0。
1mol/L 盐酸混匀后,加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA(pH8.0)(1L):186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。
(配置方法1。
称取186.1g Na2EDTA•2H2O,置于1L烧杯中. 2。
加入约800mL的去离子水,充分搅拌。
3。
用NaOH调节pH值值8。
0(约20g NaOH)。
注意:pH值至8.0时,EDTA才能溶解。
4。
加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。
6。
室温保存。
)1。
4 10×TE Buffer(缓冲液)(pH7.4,7.6,8。
0)(1L):组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。
1M Tris—HCl(pH7.4,7。
6,8。
0)取100ml,0.5M EDTA(pH8。
0)取20ml.高温高压灭菌,室温保存。
16s rdna测序原理16s rDNA测序是一种用于研究微生物群落结构和功能的重要技术,它可以帮助科研人员了解微生物的多样性和相互关系,对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16s rDNA测序的原理及其在微生物学研究中的应用。
16s rDNA是细菌和古细菌的小亚基RNA基因的一部分,它在所有细菌和古细菌中都存在,并且在细菌的进化过程中具有高度的保守性。
因此,通过对16s rDNA序列进行测序和比对,可以帮助科研人员了解不同微生物的分类和演化关系。
在进行16s rDNA测序时,首先需要从样品中提取微生物的DNA,然后通过PCR扩增得到16s rDNA的片段。
接下来,对PCR产物进行纯化和测序准备,最常用的方法是通过测序仪进行Sanger测序。
随着高通量测序技术的发展,现在也可以使用Illumina、454或Ion Torrent等平台进行高通量测序,大大提高了测序的效率和速度。
得到16s rDNA序列后,接下来的工作就是对序列进行比对和分析。
科研人员可以利用公开数据库中的16s rDNA序列作为参考,通过比对来确定待测序列的分类地位和系统发育关系。
此外,还可以利用一些生物信息学工具对序列进行多样性分析、物种丰度分析等,从而了解微生物群落的结构和功能。
在微生物学研究中,16s rDNA测序被广泛应用于环境微生物群落的研究。
通过对土壤、水体、空气等不同环境中微生物的16s rDNA进行测序和分析,可以揭示微生物的多样性、分布规律以及其对环境的影响。
此外,16s rDNA测序还可以用于研究人体内的微生物群落,例如肠道菌群的研究,有助于了解微生物与宿主健康的关系。
总之,16s rDNA测序是一种重要的技术手段,它为科研人员提供了解微生物多样性、分类和系统发育关系的重要途径,对微生物学、生态学和生物医学研究具有重要意义。
随着测序技术的不断发展和完善,相信16s rDNA测序在微生物学研究中的应用将会更加广泛和深入。
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个局部:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进展PCR扩增,电泳检测纯度与大小。
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
试剂:培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基〔培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进展洗涤。
〕。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)〔1L〕:121.1g Tris,加浓盐酸约〔70ml, 60ml, 42ml〕pH大约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液〔0.05mol/L,25Tris〕溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后,加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 0.5M EDTA〔pH8.0〕〔1L〕:186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0〔约20g〕,高温高压灭菌,室温保存。
(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O,置于1L烧杯中。
2. 参加约800mL的去离子水,充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0〔约20g NaOH〕。
注意:pH值至8.0时,EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。
6. 室温保存。
〕1.4 10×TE Buffer(缓冲液〕(pH7.4,7.6,8.0)〔1L〕:组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。
1M Tris-HCl〔pH7.4,7.6,8.0〕取100ml,0.5M EDTA〔pH8.0〕取20ml。
高温高压灭菌,室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS〔W/V〕:称10gSDS,68℃加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。