琼脂扩散实验 PPT

实验 8 单向琼脂免疫扩散试验一、目的了解单向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。

原理将某种特异性抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的抗原加入孔中。

抗体与琼脂混合后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周呈辐射状扩散，如抗原与已知的抗体相对应，在两者比例适合处即出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环，沉淀环的大小（直径或面积）与抗原浓度成正比。

以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环直径，然后从标准曲线中求得其含量。

主要用于测定血清IgG、IgM、IgA和补体成分的含量。

材料1. 抗原：待测人血清、已知含量的IgG参考蛋白2. 抗体：抗人IgG抗体3. 3%琼脂凝胶、4.5ⅹ10cm塑料板、直径3mm打孔器、注射器针头、定量加样器、湿盒（盒内铺有湿纱布）、半对数坐标纸。

方法1. 抗体琼脂板的制备（1）将3%琼脂置沸水浴加热溶化，吸取6ml加至试管内，置56水浴保温。

（2）用 0.9%生理盐水将抗人IgG抗体作适当稀释，吸取稀释好的抗人IgG6ml加至另一试管，置56℃水浴保温。

（3）将上述在56℃中保温的琼脂和已稀释好的抗体充分混匀，立即将此12ml含抗体的琼脂倾注于放在水平台上的塑料板上，待板冷却。

此抗体琼脂板的厚度为2mm，琼脂浓度为1.5%。

2. 稀释参考血清和待测血清;（1）稀释参考血清：每支冻干参考血清中加入蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成几个不同稀释度。

例如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。

参考血清稀释度1：10 1：16 1：20 1：32 1：40 1：64IgG相应含量为1166 728 583 364 291 182（2）待测血清用生理盐水作1：40稀释。

3. 打孔用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔间距15mm，用注射器针头挑出孔中琼脂，不可损坏孔缘。

4. 加样打孔后立即用微量加样器分别吸取各种稀释度参考血清10ul，准确地加到琼脂板孔中，每种稀释度加二个孔。

实验9双向琼脂扩散试验目的了解双向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。

原理将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，使两者各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两 者相遇即发生特异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。

如果所加抗原和抗体标本中分别含有若干与 血清学反应无关的抗原抗体，则因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体 复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成若干条沉淀线，一条沉淀线代表一对抗 原抗体。

因此，通过双向免疫扩散试验，可用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（抗体），可鉴定抗原性 物质性或免疫血清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点。

主要用于分析抗原或抗体成分定性鉴定；抗原、 抗体的纯度以及抗体效价的测定。

本实验以检测血清甲胎蛋白（AFP ）为例。

材料1. 1.2%生理盐水琼脂。

2. 待检血清、肝癌病人AFP 阳性血清（或脐带血）。

3. AFP 诊断血清（抗AFP 抗体）。

4. 载玻片、琼脂板打孔器、微量加样器、吸管等。

方法1. 琼脂板的制备将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂3.5ml,倾注于载玻片上，使其自 然流成水平面。

待琼脂凝固后，用打孔器按图打孔，孔径3mm,孔距5mm,挑出孔中琼脂。

2. 加样 于中央孔加入AFP 诊断血清，周围1、4孔加入已知AFP 阳性对照，2、3、5、6孔分别加 入待检血清。

（不同样本应更换吸头）3. 反应 将琼脂板放入湿盒内置37温箱中，24h 后取出观察结果。

结果观察观察孔间沉淀线的数目及特征。

本试验1、4两孔（AFP 阳性血清）与中央孔（抗AFP 抗体）之 间应出现清晰的乳白色沉淀线。

其余各孔 则根据与中央孔之间有无沉淀线的特征判 断结果。

如图所示，2孔待检血清标本与中 央孔产生沉淀线，并与相邻阳性对照所产 生的沉淀线互相融合，则表示阳性：3、5、 6孔与7孔间无沉淀线，为实验阴性。

注意事项1. 加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。

琼脂扩散试验利用可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内进行扩散，若抗原与抗体对应，并且比例适当，就会出现白色沉淀线，此为阳性反应.琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂中进行。

又可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验两类。

单向琼脂扩散试验是一种常用的定量检测抗原的方法.将适量抗体与琼脂混匀,浇注成板，凝固后,在板上打孔，孔中加入抗原，抗原就会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。

一定时间后，在两者比例适当处形成白色沉淀环.沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。

如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线,则从曲线中可求出标本中抗原的含量.本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。

双向琼脂扩散试验是将半固体琼脂倾注于平皿内或玻片上,待其凝固后,在琼脂板上打孔，将抗原、抗体分别注入小孔内，使两者相互扩散。

如果抗原、抗体相互对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰可见的沉淀线。

双向琼脂扩散法可用来分析溶液中的多种抗原。

一对抗原、抗体系统只能形成一条沉淀线，不同的抗原抗体系统在琼脂中扩散的速度不同，可在琼脂中形成不同的沉淀线.本法主要是用于检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等。

缺点是需要时间过长，灵敏度不高。

琼脂免疫扩散试验材料与试剂1．琼脂粉2．平皿3．打孔器4．生理盐水或其他缓冲液，可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。

操作方法1．称取一定量的琼脂粉，按1％左右（0.8％～1。

5%）的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min。

2．将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。

自然冷却。

3．根据要求（孔径即孔的直径,孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。

也可直接用组合打孔器打孔。

现在一般多打成梅花形孔图。

4．挑出孔内琼脂,注意不要挑破孔缘。

5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。