樟叶越桔叶芽总RNA提取方法比较研究

樟树5种化学类型叶片转录组分析江香梅;伍艳芳;肖复明;熊振宇;徐海宁【摘要】樟树(Cinnamomum camphora )是樟科植物的一个代表种,具有材用、药用、香料、油用和生态环境建设等多种用途.叶精油中富含利用价值极高的樟脑、芳樟醇、1,8-桉叶油素、异-橙花叔醇和右旋龙脑等萜类化合物.依据叶精油中主要成分的种类和含量,可将樟树划分为脑樟、芳樟、油樟、异樟、龙脑樟5种化学类型.文章采用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术,对5种化学类型叶片转录组进行测序,对测序得到的所有Unigene进行GO(Gene Ontology)、COG(Clustersof Orthologous Groups)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分类,给出功能注释和Pathway注释,并预测Unigene蛋白编码区(Coding sequence,CDS).De novo组装共获得156 278个Unigene,序列平均长度584 bp,N50(覆盖50%所有核苷酸的最大Unigene长度)为1 023 bp.通过与其他核酸、蛋白数据库的Blast搜索比对,共有55 955条Unigene获得了基因注释,占所有Unigene的35.80%.其中,有24 717条Unigene得到GO注释,有21 806条Unigene得到COG注释.KEGG pathways分析结果表明,共有3 350条基因(10.19%)注释到次生代谢生物合成途径,其中参与单萜、二萜、倍半萜和萜类骨架合成的Unigene有424个.在单萜合成的代谢通路中,有9条Unigene可能编码芳樟醇合成酶基因,且表达分析结果显示,芳樟醇合成酶基因在芳樟化学类型中优势表达,在油樟化学类型中表达水平较低.这些注释信息的完成为樟树功能基因及相关候选基因的发掘提供了基础数据和重要依据.【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2014(036)001【总页数】11页(P58-68)【关键词】樟树;RNA-Seq;基因注释;功能分类;CDS预测【作者】江香梅;伍艳芳;肖复明;熊振宇;徐海宁【作者单位】江西省林业科学院,国家林业局樟树工程技术研究中心,南昌,330032;江西省林业科学院,国家林业局樟树工程技术研究中心,南昌,330032;江西省林业科学院,国家林业局樟树工程技术研究中心,南昌,330032;江西省林业科学院,国家林业局樟树工程技术研究中心,南昌,330032;江西省林业科学院,国家林业局樟树工程技术研究中心,南昌,330032【正文语种】中文樟树(Cinnamomum camphora (L.) Presl)是我国特有国家Ⅱ级保护树种,是集材用、药用、香料、油用、化工、观赏、生态环境和生态文化建设等于一体的多用途树种,可作为樟科的代表种,具有极重要的开发利用价值[1]。

一种木本植物RNA和DNA的简捷提取方法摘要：将尾叶按(Eucalyptus urophylla)叶片在液氮中研磨成粉，先用含山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白、聚乙二醇和亚精胺的提取缓冲液使总核酸沉淀，同时去除了大部分次生代谢物质。

然后用山梨醇、月桂酰肌氨酸钠进一步裂解细胞，释放核酸。

再用CTAB与核酸结合成复合物溶于高盐溶液。

用氯仿／异戊醇除蛋白质后，离心得含总核酸的上清液。

运用钙盐分步沉淀法，先在上清液中加入1／10体积的10％氯化钙溶液，使DNA与Ca2+结合成DNA钙盐。

向溶液中加入1／5体积的乙醇，使DNA钙盐形成沉淀析出，离心得DNA后，再增大乙醇浓度使RNA钙盐沉淀。

得到的DNA和RNA用非变性琼脂糖凝胶进行质量检测，可得完整的RNA和DNA条带。

此法经济、快捷，可同时得到DNA 和RNA。

关键词：木本植物；RNA；DNA；非变性琼脂糖电泳木本植物的组织中含有较多的多糖及单宁、酚、醌、原花色素类物质等次生代谢物质。

这些物质严重影响木本植物RNA和DNA提取效率，甚至造成提取失败而成功提取高质量的RNA和DNA是进行分子生物学研究的必要前提，如Nofthera杂交分析、cDNA文库构建、RT—PCR、Southern杂交分析等实验都需要高质量的RNA或DNA。

常用于植物RNA或DNA提取的方法有异硫氰酸胍法、热硼酸法、CTAB法、SDS法等。

这些方法对于某些植物的核酸提取是有效的，但对另外一些植物来说，却并不一定是好的方法。

对于木本植物而言。

由于其次生代谢物质含量丰富，这些物质的化学性质又与核酸相似，所以提取过程中，次生代谢物质会严重干扰核酸的提取，影响核酸的得率及质量，甚至导致提取失败。

目前，常规的核酸提p提取缓冲液：50 mmol／L Tris(pH值8.0)、35mmol ／L山梨醇、5 mmol／L EDTA、10％(W／V)聚乙二醇4000、5％(W／V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.2％(W／V)亚精胺和0.1％(W／V)牛血清白蛋白。

樟树挥发油的提取及包合物制备与鉴定研究摘要：目的比较湖南樟树老叶、嫩叶、落叶、籽中挥发油含量差异，制备樟树挥发油的β-环瑚精包合物并对其进行鉴定。

方法采用水蒸气蒸馏法提取挥发油；以挥发油包合率为评价指标，对研磨法、饱和水溶液法、超声法进行比较，并采用正交试验法优选研磨法的最佳包合工艺条件；通过薄层色谱法、紫外可见吸收光谱法、差示扫描量热法对包合物进行鉴定。

结果6-7月的样本中，樟树挥发油的平均得率分别为老叶1.58%、嫩叶1.52%、落叶0.84%、籽1.39%。

优选的包合方法为研磨法，最佳包合工艺为β-环瑚精与挥发油的投料比为10∶1，加4倍量水，研磨2 h。

樟树挥发油包合前后的薄层色谱、紫外可见吸收图谱均无差异；包合物、β-环瑚精、挥发油、β-环瑚精与油物理混合物的热分析图谱有显著差异。

结论樟树挥发油的含量以老叶较高；本试验优选的包合工艺合理、稳定。

关键词：樟树；挥发油；β-环瑚精包合物DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.027中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0086-03Abstract：Objective To study the content of volatile oilfrom old leaves，tender leaves，fallen leaves and seeds of cinnamomum camphora tree in Hunan，China. To prepare and identify the volatile oil of its β-cycoldextrin inclusion compound. Methods The volatile oil was extracted bywater-steam distillation. With inclusion rate as the index，trituration method，saturated water solution method and ultrasound method were compared. The optimum conditions were investigated by the orthogonal test. The inclusion compound was identified by thin-layer chromatography （TLC），ultraviolet visible spectrum （UV-Vis）and differential scanning calorimetry （DSC）. Results From June to July，the average content of volatile oil extracted from old leaves，tender leaves，fallen leaves and seeds were 1.58%，1.52%，0.84% and 1.39%，respectively. The optimum preparation conditions were as follows：the ratio of β-cyclodextrin and volatile oil was 10∶1，the adding water was 4 times and inclusing time was 2 h. Before and after inclusion，the spectrum of TLC and UV-Vis of volatile oil showed no obvious change. The DSC of inclusion compound，β-cycoldextrin，volatile oil and the mixture had significant differences. Conclusion The amount of the volatile oil from old leaves is higher. The optimized condition of inclusion is stableand reasonable.Key words：camphor tree；volatile oil；β-cyclodextrin inclusion樟树Cinnanonum camphora为樟科常绿乔木，在我国资源丰富。