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农杆菌菌株的培养及感受态细胞的制备
挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（链霉素100mg/ml），28℃振荡培养过夜
取过夜培养菌液500μl接种于50mlYEB（链霉素100mg/ml）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5 左右。
5000rpm离心5min，集菌。
加10ml0.15MNaCl悬浮细胞，5000rpm离心5min，
加10ml预冷的20mMCaCl2悬浮细胞，冰浴，24小时内使用，或分装成每管200μl，液氮中速冻1min，置于-70℃保存备用。
植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化
取200ml 感受态细胞，加入1μg构建好的质粒DNA加入到，混匀后，冰浴30min。
液氮中速冻2-3min，37℃水浴5min，接着冰浴3min。
加入1mlYEB培养基，28摄氏度慢速震荡培养4h。
5000rpm离心5min，弃上清，集菌。
加入0.1mlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100mg/ml Kan和125mg/ml Sm的YEB 平板上，28℃培养
阳性克隆的鉴定
挑取平板上长出的单菌落，接种于含有100mg/ml Kan和125mg/ml Sm的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。
农杆菌菌液的制备
挑取继代2d后的农杆菌单菌落，在加有相应抗生素的液体YEB培养基中，在28℃黑暗条件下震荡培养16-20h（OD600为0.6-0.8）
将菌液置于离心管中，18-20℃，5000rpm离心5min收集菌体。
将收集到的菌体用2mlD-inf液体培养基悬浮进行洗涤，以去除残余的YEB培养基
18-20℃，5000rpm离心10min收集菌体，将菌体用2mlD-inf液体培养基，加入1‰AS，备用（放1h）
农杆菌感染玉米幼胚初生愈伤及共培养
将加入到D-inf（含AS）的菌液稀释到OD600为0.3-0.5放置1h以上，将幼胚或愈伤用D-inf（不含AS）洗一次，再浸入菌液中，用手上下颠倒30s，并放置5min，观察幼胚无明显伤口时，取出，用无菌滤纸吸干，放到D-AS固体培养基上，25℃黑暗条件下共培养3d，同时设对照。
植物受体材料幼胚、愈伤组织的制备
愈伤组织的准备：玉米授粉后10-13d，取玉米幼穗在超净台上剥去苞叶，取出幼胚，将幼胚盾片朝上，接种于D培养基上，每培养皿接20-40个幼胚，28℃培养2-3d后，即可诱导出愈伤组织。
幼胚的准备：剥去苞叶、丝及一些多余部分，用刀插入上部，放入70%的乙醇，进入超净台，30s，拿出，超净台上吹干约15-20min，剥去玉米粒的2/3的表面部分，剥幼胚。
玉米转化体的筛选、继代和植株再生
恢复培养的阶段：将共培养3d后的幼胚在灭菌水（加1‰的cef）中洗3次，每次20min，然后用滤纸吸干，转入D-cef固体培养基上，25℃，暗处，恢复培养7d。
选择加压筛选阶段：分4次
第一轮D培养基+cef（1‰）+PPT（5mg/ml）
第二轮D培养基+cef（1‰）+PPT（10mg/ml）
第三轮D培养基+cef（1‰）+PPT（10mg/ml）
第四轮D培养基+cef（1‰）+PPT（10mg/ml）
每轮间隔均为2周；其中AgNO3可加（1‰或0.5‰）可不加，或一次加而另一次不加；cef使用浓度250mg/L，存储液浓度为250mg/ml；PPT存储液浓度为10mg/ml。
筛选后的恢复阶段：D培养基+6-BA（5mg/L），其中2,4-D或Dicamba浓度稀释5倍，蔗糖30g/L（或蔗糖20g/L，葡萄糖10g/L），时间为2周，暗培养。
筛选后的诱导阶段：D培养基+6-BA（5mg/L），其中2,4-D或Dicamba浓度稀释5倍，蔗糖50g/L，不加葡萄糖+cef1ml/L，暗培养。
分化阶段：D培养基，但不加任何激素，蔗糖浓度30mg/L不加葡萄糖，+cef1ml/L，光照培养。
生根阶段：
培养基及母液的配置
D-培养基
NaFeEDTA 10ml/L
N6 macro 50ml/L
B5 micro 10ml/L
Di comba(2,4-D) 1ml/L(5ml/L)
RTV 10ml/L
Casamina acids(酪蛋白水解酶) 0.5g/L
L-Prine 700mg/L
肌醇100mg/L
Sucrose 20g/L
PH 5.8
N6大量元素
组成成分终浓度(mg/l）20×（g/L）
硝酸钾KN032830 56.6
硫酸铵(NH4) 2SO4 463 9.26
硫酸镁MgSO4·7H20 185 3.7
磷酸二氢钾KH2PO4400 2.58
氯化钙CaCl2·2H2O 166 3.32
(或无水氯化钙CaCl2 2.58 )
配2L时，称取6.64gCaCl2·2H2O溶于600-700ml蒸馏水中，称取其他成分溶于600-700ml 蒸馏水中，分别溶解后，再混合到一起，定容至2000ml
B5微量元素
组成成分终浓度(mg/l）100×（mg/500ml）
MnSO4·H2O 10 378.93
MnSO4·4H2O 10 500
ZnSO4·7H2O 2.0 100
H3BO4 3.0 150
KI 0.75 37.5
Na2MoO4·2H2O 0.25 12.5
CoCl2·6H2O 0.025 1.25
CuSO4·5H2O 0.025 1.25
Fe盐
