正文-浙江师范大学生化学院

从积极心理学视角关注中学生情感发展积极心理学侧重于关注人类的潜能、动力和能力，研究积极的品质。

本文借鉴积极心理学的三个层面来反思当下中学生情感教育现状，并提出相关的建议。

标签：积极心理学中学生情感发展建议一、积极心理学主要观点积极心理学是20世纪末兴起于美国的一个新的研究领域，致力于研究人的发展潜力和美德等积极品质的一门学科。

它倡导从心理学的视角研究积极取向，关注人类积极的心理品质，强調人的价值与人文关怀。

具体而言积极心理学可分为以下层面：在主观的层面上是研究积极的主观体验；在个人的层面上，是研究积极的个人特质；在群体的层面上，研究公民美德和使个体成为具有责任感、利他主义、有礼貌、宽容和有职业道德的公民。

积极心理学改变了传统那种偏向问题的价值取向，把自己的工作重心放在培养人固有的积极潜力上，通过培养或扩大人固有的积极力量而使人真正成为一个健康并幸福生活的人[1]。

二、立足于积极心理学视角的原因中学时期的情感教育是一个关键，处于这个年龄阶段学生的由于生理发育的加速和性发育走向成熟，往往使他们感到不适应，出现不平衡的感受及种种矛盾以及困惑。

对中学生的情感教育处理不妥当可能会多走弯路甚至误入歧途。

在这个关键的时期，教师作为一个引导者的身份需要对学生的心理特点做准确的分析，进行恰当的定位。

积极心理学倡导的观点是致力于发现人的发展潜力和美德等积极品质，这在一定程度上与教学的理念中培养每一个学生的科学素养不谋而合。

本文就从积极心理学的视角帮助教师关注中学生的心理发展。

三、关注中学生情感发展1.获得积情绪体验其中包括积极的主观体验，这指得是对过去的满足和幸福感形成、对现在的快乐和幸福、对未来希望和乐观，，以及它们的生理机制以及获得的途径。

满足、希望、快乐和幸福是积极的主观体验所蕴含的，然而这些又何尝不是现在教育所追求的目标。

如今，每一位学子的肩膀上都背负着亲友的期盼、学校升学率的要、竞争日益剧烈的社会等等的重担，越来越多的压力剥夺了学生原本可以享受美好生活时光的机会。

茶花无土盆栽体系初探澎江廖升学2008年第6期墨茶花无土盆栽体系初探路梅,徐传雨,金文福,费春琴,孙怡(1.浙江师范大学生化学院,浙江金华321004;2.浙江省金华出入境检验检疫局,浙江金华3210023.金华阿福花卉有限公司,浙江金华321001)摘要:以茶花飞爪芙蓉为材料,以较为廉价的泥炭,珍珠岩,木屑等为基质来源,进行茶花无土盆栽试验.初步的结果表明,75%泥炭+25%珍珠岩组成的混合基质已基本满足飞爪芙蓉无土盆栽需求,而木屑则不适合同时使用.关键词:茶花;无土盆栽中图分类号:$685文献标识码:B文章编号:0528—9017(2008)06—0693—04茶花是我国着名的传统花卉,也是世界的名贵花木.其花色艳丽多变,花容娇美,密叶苍绿,经冬不凋,深受各国人民喜爱.具有”中国茶花之乡”美称的浙江省金华市,目前茶花盆花生产已达到较大规模,但基本以内销为主,鲜有出口,极大限制了产业的发展.因为传统的黄土栽培方式,与当前国内外市场上要求趋向以轻质,廉价,洁净的非土栽培基质料相悖.因而进行茶花无土盆栽已成为必然.无土栽培作为一种农业高新栽培技术在我国的起步虽然较晚,但其发展势头迅猛,发展前景极为[9][10]11][12][13][14][15][16]广阔.刘琬¨对杜鹃盆花,王国良对切花月季,孙映波等对广东主要盆花,刘登民等对牡丹,汪天对香石竹和非洲菊等的研究表明,无土栽培可明显使植株根系再生能力加强,生长发育速度加快,可克服连作障碍,减少土壤传播病害,改善盆花和切花的质量.茶花无土栽培大都处于起步摸索阶段.大多无土栽培的茶花存在生长力弱,存活差的弱点;而且部分研究采用的不是严格意义上的无土栽培基质,其添加的一些成分不能达到输入国对出口花卉栽培基质的要求.因此,我们进行了茶花无土盆栽条件探索试验,目的在于明确其无土盆栽收稿日期:2008.03,24基金项目:金华市科技项目(2006.O1.27)作者简介:路梅(1976一),女,山东FI照人,工程师,主要从事生物技术工作. 6(5):20—23.沈盎绿,马胜伟,陈亚瞿.褶牡蛎对悬沙胁迫的生理响应研究[J].上海环境科学,2007,26(1):27—30.刁正俗着.中国水生杂草[M].重庆:重庆出版社,1990.国家环境保护局科技标准司.湖泊污染控制指南M].北京:中国环境科学出版社,1997.金送笛,李永函,倪彩虹,等.菹草对水中氮,磷的吸收及若干影响因素[J].生态学报,1994,16(2):168—173.李合生.植物生理生化试验原理与技术[M].北京:高等教育出版社,2000:153—203.陈开宁,强胜,李文朝.蓖齿眼子菜的光合速率及影响因素[J].湖泊科学,2002,14(4):357—362.王泽港,骆剑峰,刘冲.单一重金属污染对水稻叶片光合特性的影响[J].上海环境科学,2O04,23(6):240—243.苏文华,张光飞,张云孙,等.5种沉水植物的光合特征[17][18][19][2(]][21][22][J].水生生物学报,2004,28(4):391—395,陈愚,任久长,蔡晓明镉对沉水植物硝酸还原酶和超氧化物歧化酶活性的饿影响J].环境科学学报,1998,18(3):313—317.苏胜齐,沈盎绿,唐洪玉,等.温度光照和pH对菹草光合作用的影响[J].西南农业大学学报,2001,23(6):532—534.栾会妮,黄福祥,姚维志.环境因子对穗状狐尾藻光合作用的影响[J].重庆水产,2005,71(2):31—37.金送笛,李永函,王永利.几种生态因子对菹草光合作用的影响[J].水生生物学报,1991,15(4):295—302.谷巍,施国新,张超英,等.H,cd和cu对菹草光合系统及保护酶系统的毒害作用[J].植物生理与分子生物学学报,2002,28(1):69—74.沈盎绿,沈新强.柴油对斑马鱼超氧化物岐化酶和过氧化氢酶的影响[J].海洋渔业,2005,27(4):314—318.团澎江右升学2008年第6期基质配方,为金华市茶花出口提供技术支持.l材料与方法1.1材料1.1.1供试材料茶花为飞爪芙蓉3年生扦插苗.1.1.2基质配方选取泥炭,木屑和珍珠岩为栽培基质,按一定比例混合而成:M(3泥炭+1珍珠岩),M(2泥炭+1珍珠岩),M(2泥炭+1珍珠岩+1木屑),M(1泥炭+1珍珠岩+2木屑);以黄土为对照.1.1.3营养液使用欧洲标准Sonneveld营养液,pH值保持在5.5～6.5.1.2方法1.2.1试验设计7月上旬,选取茶花3年生健康扦插苗.先用清水把根部泥土冲洗干净,剪去残根;称鲜重,测株高和冠幅.将选用的植株根移入盛有不同混合基质的大小适合的简易花盆中定植.各处理定植植株20株,设置3个重复.定植后用自来水浇灌透彻,移人大棚内.大棚用75%的遮阳网覆盖2层,上层遮阳网间隔1m.自第3周开始,每周使用1次营养液,间或配合使用叶面肥,通风保持适宜的温湿度.40d后,移出大棚,进行室外管理.11月中旬,试验结束,随机取样,测定茶花生长状况指标(包括株高,干重,鲜重,植株营养元素和叶绿素含量及根系活性等)和基质的理化性质,各数值检测3次,计算平均值.1.2.2盆栽基质理化性质的测定容重,持水量,孔隙度测定:取风干基质加满体积为125ml塑料三角瓶(三角瓶重量W=50g),称重,然后浸泡水中24h称重,,将容器口用一已知重量(W)的湿润纱布包住,把容器倒置,让容器中的水分流出,直至没有水渗出,称重(W).容重(g/~111,):(W,一)/125;持水量(%)=(IV4一一,)×100/1V.;总孑L隙度(%)=(,一,)/125×100.电导率(EC值):取风干基质5g,加蒸馏水25ml,振荡30min,用DDS.11A电导仪测定.pH值:取风干基质5g,加蒸馏水25Hd,振荡30min,HANNA公司生产的pH计测定.碱解氮采用碱解扩散法;有效磷采用盐酸一氯化铵法;速效钾采用乙酸铵提取法j.1.2.3茶花生长状况指标的测定株高:根上部到顶芽的距离(cm).鲜重与干重:试验完全结束后,将植株取出用自来水洗净根系,再用去离子水清洗2～3遍,分为地上部与地下部称出鲜重后,分别置于烘箱内在105℃条件下烘干3h后,分别称出干重(g).叶绿素含量:采用95%乙醇提取分光光度计比色法.硝酸还原酶测定:采用磺胺比色法.根系活力测定:采用替代改良Trc方法.植株叶片全氮含量l称取1g试样加入三角瓶中,用5gK2SO:CuSO=9:1的混合盐和99%浓H,s025nll混合后,在高热电炉中加热溶解;完全溶解放置冷却1h后,用250ml蒸馏水稀释;取25rIll稀释液用32%NaOH和5Ⅱl1的2%硼酸蒸馏, 再用HsO标准液测定.植株叶片磷含量:采用V anadate法,使用Shimaduv2100比色计在470nm处比色定量.植株叶片K,Ca,Fe,Mn,Cu,Zn含量:称取斌材0.5g于100ml三角瓶内,注入5ml硝酸和1ml高氯酸,在密封消煮罐中170oC消煮8h,然后将消煮液定容到5Ond的容量瓶中测定原子吸收, 用的是岛津AA.6800型原子吸收分光光度计.2结果与分析2.1基质理化性质由表1可知,盆栽近5个月后,盆栽基质在试验开始时与结束后的理化性质发生变化.相比对照CK而言,4种无土基质处理具有较高的空隙度和较低的容重(<0.3g/crn3),说明所选无土栽培基质组合后的通气性较好,并且很利于盆花的生产流通和消费;M,M,M和M中N,P,K等主要营养元素的含量,远远高于CK中的含量,说明所选无土栽培基质组合后的营养均高于大田种植用的黄土. 基质孔隙度与持水量均有增加,说明所有各类混合基质具备较好的物理性质;基质容重和pH值变化不大,表明基质的物理性质和酸碱度基本保持稳定,利于茶花的生长;由于营养液的持续使用,基质盐分积累明显,致使EC值的增幅较大.此外,在营养元素方面,N和K变化不一,其中M,和M均有增加,M和M却相对降低很多,对照CK变化不大;各处理有效磷的变化最大,增加达路梅,等:茶花无土盆栽体系初探雹数10倍,将有助于植株花芽的分化和花朵的形成.2.2植株生物量从表2可知,地上部鲜重各基质处理间差异显着;M根部鲜重和整株鲜重明显大于M:,M,M和CK.表明M.基质对盆栽茶花育苗促长明显优于M,M,M处理.株高差异显着,M,M处理的株高明显偏低,说明木屑不适合用做盆栽茶花的无土基质.表2不同基质处理对飞爪芙蓉植株生物量和株高的影响注:表中同列数据后含不同小字字母表示差异达显着. 2.3植株主要生理指标表3表明,M基质处理的植株叶绿素总含量和硝酸还原酶活性均高于其它处理,TYC还原强度仅略低于M,处理;而M处理的植株叶绿素总含量和硝酸还原酶活性的最低,Trc还原强度仅略高于CK.试验结果说明,在4种处理中,M,最适合飞爪芙蓉的盆栽要求.2.4叶片营养元素含量表4的结果显示,飞爪芙蓉植株叶片在试验结束后的营养元素含量表现为基质M中大量元素N,P,Ca含量最高,K含量最低,表明该类基质条件下比较有利于植株的生长,而且茶花的生长状况指标最大(表2);其它类基质上的茶花叶片N,P,表3不同基质处理对飞爪芙蓉植株主要生理指标的影响K,ca含量各有高低,但差异不显着.微量元素Fe,Mn,Zn,Cu的含量方面,综合分析结果还是M.表现优良,其Fe含量最高,zn和cu含量仅次盔澎江考彳千学2008年第6期表4实验结束后飞爪芙蓉植株叶片的营养元素含量于M,表明对叶绿素含量有正面影响,即在其它条件相同的情况下,M,类基质上生长的茶花植株长势最旺且生长量大.从叶绿素含量比较(表3)的直观分析亦可看出,M类基质上生长的试材植株叶绿素含量最高,与上述结果一致.此外,飞爪芙蓉微量元素含量水平普遍高于常规栽培植物的平均水准,如常规植物一般Mn量均在100mg/kg左右,含zn量在20～30mg/kg,Cu的含量极微.而本试验的结果测得茶花叶片的微量元素含量平均高出常规植物,如Mn高出40～60倍,zn高出2～3倍.相反,铁含量偏低,常规含量为100～200mg/kg.表明飞爪芙蓉好酸忌碱,是由于其体内的微量元素含量水平偏高为保证植物体自基质或土壤中有效吸收利用生长必需的,尤其对叶绿素形成起至关重要作用的各类微量元素,酸性的栽培环境不可或缺.3小结茶花植物属于典型的酸性土壤指示植物.M(3泥炭+1珍珠岩)适合茶花飞爪芙蓉盆栽要求,而木屑则不适合同时使用.无土栽培体系的建立和完善,尚需及时开展后续的研究工作,如不同混合基质处理下茶花花芽的萌发研究等.此外,茶花品种繁多,本研究的结果可供试验参考,却不能简单的推而广之.参考文献:刘琬.杜鹃花无土栽培试验与研究[J].湖南林业科技, 1995,22(1):16—19.王国良.切花月季试管苗无土高产栽培研究[J].南京林业大学学报,1994,18(1):37—41.孙映波,马曼庄,段昆生,等.广东主要盆花无土栽培技术研究[j].广东农业科学,1997(5):28—30刘登民,宋金斗,吴善明,等.牡丹无土栽培技术初报[J].山东林业科技,1998(5):11—13.汪天.香石竹,非洲菊有机生态型无土栽培技术研究[J].沈阳农业大学学报,2000,31(4):386—388李合生.植物生理生化实验原理和技术【M].北京:高等教育出版社,2000:134—137.林大仪.土壤学实验指导[M].北京:中国林业出版社, .张志良.植物生理学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1990.郁书君,汪天,金宗郁,等.白桦容器栽培实验(I).最适基质配方的筛选[J].北京林业大学学报,23(1): 24—28. 一’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’[标签:快照]。

第３４卷第３期浙江师范大学学报（自然科学版）Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．３２０１１年８月 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．） Ａｕｇ．２０１１ 文章编号：１００１－５０５１（２０１１）０３－０３３３－０６氧化还原因子－１的原核表达纯化及其活性鉴定丁正中１，　张　璐２，　李　涛１（１．浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华　３２１００４；２．艾青中学，浙江金华　３２１０１５）摘　要：为建立氧化还原因子－１（Ｒｅｆ－１）的原核表达系统，将经过酶切后的人源Ｒｅｆ－１编码片段定向克隆到ｐＧＥＸ－４Ｔ－３载体上，构建了ｐＧＥＸ－４Ｔ－３／Ｒｅｆ－１原核表达载体，重组质粒转化至ＢＬ２１（ＤＥ３）工程菌，异丙基－β－Ｄ－硫代吡喃半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白，谷胱甘肽琼脂糖凝胶４Ｂ（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａ－ｒｏｓｅ４Ｂ）亲和纯化重组蛋白，透析后用聚乙二醇８０００（ＰＥＧ８０００）浓缩，获得纯度达９２％的融合蛋白，产率为３．７ｍｇ／Ｌ，融合蛋白占菌体总蛋白的６．８％．蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）显示该蛋白可以被抗体特异性识别，证实其为ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白．ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１蛋白体外增强了激活蛋白－１（ＡＰ－１）的ＤＮＡ结合能力，并能拮抗Ｈ２Ｏ２造成的ＡＰ－１氧化损伤．关键词：氧化还原因子－１；融合蛋白；原核表达；亲和色谱法中图分类号：Ｑ７８６ 文献标识码：ＡＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｄｏｘｆａｃｔｏｒ１ＤＩＮＧＺｈｅｎｇｚｈｏｎｇ１，　ＺＨＡＮＧＬｕ２，　ＬＩＴａｏ１（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＪｉｎｈｕａＺｈｅｊｉａｎｇ　３２１００４，Ｃｈｉｎａ；２．ＡｉｑｉｎｇＭｉｄｄｌｅＳｃｈｏｏｌ，ＪｉｎｈｕａＺｈｅ－ｊｉａｎｇ　３２１０１５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｒｅｄｏｘｆａｃｔｏｒ－１（Ｒｅｆ－１），ｔｈｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｅｎｃｏ－ｄｉｎｇＲｅｆ－１ｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐＧＥＸ－４Ｔ－３ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｅｌｌｓ．ＡｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｂｙＩＰＴＧ，ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｈｏｗｅｄａｈｉｇｈｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓ－ｓｉｏｎｉｎｓｏｌｕｂｌｅｆｏｒｍ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈ－ａｒｏｓｅ４ＢａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｂｙＰＥＧ８０００．ＰｕｒｉｆｉｅｄＧＳＴ－Ｒｅｆ－１ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎａｃｃｏｕｎｔｅｄｆｏｒ６．８％ｏｆｔｏｔａｌｂａｃｔｅ－ｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｙｉｅｌｄｗａｓ３．７ｍｇ／Ｌ．Ｉｔｓｐｕｒｉｔｙｗａｓｏｖｅｒ９２％．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｕｌｄｒｅ－ａｃｔｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｗｉｔｈａｎｔｉ－Ｒｅｆ－１ａｎｔｉｂｏｄｙ．ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡＰ－１ａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｅｄＨ２Ｏ２－ｍｅｄｉａｔｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｉｎｊｕｒｙｏｆＡＰ－１．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｅｆ－１；ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ收文日期：２０１０－１１－１７；修订日期：２０１１－０２－２８　基金项目：金华市科学技术研究计划项目（２０１０－３－０７１）　作者简介：丁正中（１９８７－），男，浙江义乌人，硕士研究生．研究方向：分子生物学．　通信作者：李　涛．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｔａｏ＠ｚｊｎｕ．ｃｎ 氧化还原因子－１（Ｒｅｆ－１）是哺乳动物细胞中重要的双功能蛋白，在ＤＮＡ损伤修复及抗氧化防御屏障中发挥着关键作用．Ｒｅｆ－１由３１８个氨基酸残基构成，分子量约为３７ｋＤ，包含２个主要功能域．Ｒｅｆ－１的Ｃ端功能区进化高度保守，约１５７个氨基酸，具有核酸内切酶活性．离子辐射、活性氧（ｒａｄｉｃａｌｏｘｙｇｅｎｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ＲＯＳ）和烷化剂等可引起ＤＮＡ损伤，造成脱嘌呤／脱嘧啶位点（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃｓｉｔｅｓ，ＡＰ位点）．Ｒｅｆ－１是ＡＰ位点碱基切除修复（ｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒ，ＢＥＲ）途径中主要的限速酶［１］．如果Ｒｅｆ－１的这一功能缺陷，将造成ＡＰ位点累积，诱导细胞凋亡．放射治疗、烷化剂及核苷酸类似物药物（如：博莱霉素、替莫唑胺、吉西他滨等）均可显著增强Ｒｅｆ－１蛋白表达，是肿瘤细胞产生获得性耐药，最终导致药物失敏的重要机制［２－４］．Ｒｅｆ－１独特的亲水性Ｎ末端由约１２７个氨基酸组成，种属差异较大，该段序列赋予Ｒｅｆ－１氧化还原酶活性．氧化损伤造成半胱氨酸巯基发生二硫键交联、Ｓ－硝基化、谷胱甘肽化．通过还原半胱氨酸残基，Ｒｅｆ－１能回复氧化损伤蛋白的功能活性．Ｒｅｆ－１能显著促进许多转录因子的激活并提高它们的ＤＮＡ结合能力，这代表了信号转导中一种新型的氧化还原调控模式，对真核基因表达意义重大［５］．氧化应激条件下，Ｒｅｆ－１表达增高或磷酸化活化，引起参与氧化还原调节的激活蛋白－１（ＡＰ－１）等转录因子活性变化，进而引起下游靶基因的活化，使一些对细胞具有保护作用的蛋白得到表达．因此，抑制Ｒｅｆ－１氧化还原酶活性，亦能促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖．Ｒｅｆ－１的高表达、活性增高及亚细胞定位改变与多种肿瘤的发生有关，并关系到肿瘤的恶性程度以及放化疗的敏感性［６－８］．如何抑制Ｒｅｆ－１的表达或活性，是目前肿瘤靶向治疗的重要课题．本实验通过原核表达纯化人源Ｒｅｆ－１蛋白，建立了其活性检测体系，为进一步研究Ｒｅｆ－１蛋白的功能、筛选Ｒｅｆ－１特异性抑制剂建立前期基础．１　材料与方法１．１　材料菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）和质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－３为浙江师范大学动物生理实验室保存．ｐＲｃ／ＲＳＶ－Ｒｅｆ－１质粒由日本名古屋大学ＦｕｋｕｓｈｉＫａｍｂｅ教授惠赠．１．２　原核表达载体的构建ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａⅠ双酶切将Ｒｅｆ－１编码片段从ｐＲＣ／ＲＳＶ真核表达载体中释放出来，插入ｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔⅡＳＫ（＋）相应位点．ｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔⅡＳＫ（＋）／Ｒｅｆ－１质粒经ＳａｌⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切释放Ｒｅｆ－１编码片段，插入ｐＧＥＸ－４Ｔ－３相应位点，完成Ｒｅｆ－１原核表达载体的构建．挑取单克隆进行酶切鉴定，并由北京奥科公司测序，确定基因正确插入且无突变．１．３　ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白的表达重组质粒转化感受态细菌ＢＬ２１，挑克隆，在含氨苄西林（Ａｍｐ）的ＬＢ培养基上摇菌过夜．将５０ｍＬ培养液扩大培养至１０００ｍＬＬＢ培养液中２２０ｒ／ｍｉｎ培养２～４ｈ，使Ａ６００＝０．６，降低温度至３０℃，加异丙基－β－Ｄ－硫代吡喃半乳糖苷（ＩＰＴＧ）至终浓度为０．４ｍｍｏｌ／Ｌ，摇菌４～６ｈ．收集菌液，每１０００ｍＬ细菌用４０ｍＬ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）重悬，冰上超声直至液体不再混浊，４℃，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，收集上清液．分别取诱导前后的培养液及超声离心后的上清液和沉淀，加入２×十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）上样缓冲液，煮沸后进行ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ），分析融合蛋白的表达情况．１．４　ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白的纯化加１ｍＬ５０％谷胱甘肽琼脂糖凝胶４Ｂ（Ｇｌｕｔａ－ｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）溶液至超声后的上清液中，室温下垂直混悬器混悬结合过夜，４℃，５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后，收集珠子，预冷的１ｍＬ磷酸盐缓冲液洗５遍，离心后收集珠子，加１ｍＬ１０ｍｍｏｌ／Ｌ还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液，垂直混悬器轻轻混悬２０ｍｉｎ，４℃，５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，吸出上清液置新管中．再重复洗涤３次，分别收集上清液．将上清液收集入透析袋，４℃透析３次，每４ｈ更换透析液（ＰＢＳ），聚乙二醇８０００（ＰＥＧ８０００）浓缩至１ｍＬ，加入终含量为１０％的甘油，含０．５ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇（ＤＴＴ），－８０℃保存．纯化后的蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，考马斯亮蓝染色检测条带．谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）按上述方法表达纯化．３　第３期 丁正中，等：氧化还原因子－１的原核表达纯化及其活性鉴定１．５　蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）分别取１０μＬ纯化的ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１及ＧＳＴ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，湿式电转化转膜．以兔源Ｒｅｆ－１抗体为一抗，辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的抗兔抗体为二抗，用电化学发光（ＥＣＬ）显色试剂盒显影曝光，鉴定表达产物．１．６　ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１氧化还原酶活性的检测应用凝胶阻滞法检测ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１氧化还原酶活性．按文献方法提取ＨｅＬａ细胞核蛋白，建立体外反应体系［９－１０］．北京奥科公司合成转录因子ＡＰ－１特异识别的双链探针，正链序列为５′－ＣＧＣＴ－ＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＧＡＡ－３′．Ｔ４多聚核苷酸激酶对探针进行末端３２Ｐ标记．在每组反应混合物中，核蛋白用量为４０μｇ，ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１的用量是４００ｎｇ．核蛋白与ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１体外混匀后，用终浓度为２０ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２Ｏ２４℃处理１５ｍｉｎ后，用６％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示ＡＰ－１蛋白与探针ＤＮＡ结合条带．２　结果与分析２．１　Ｒｅｆ－１原核表达载体的构建及鉴定Ｒｅｆ－１原核表达载体的构建流程如下：首先，用ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａⅠ双酶切将Ｒｅｆ－１编码片段从测序正确的ｐＲＣ／ＲＳＶ真核表达载体中释放出来，之后将Ｒｅｆ－１编码片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔⅡＳＫ（＋）相应位点，经鉴定２－４泳道的克隆均为正确插入目的基因的重组质粒（见图１（ａ））；接着，用ＳａｌⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切释放约１ｋｂ的Ｒｅｆ－１编码片段，插入ｐＧＥＸ－４Ｔ－３相应位点，从而完成ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１原核表达载体的构建，经鉴定８泳道的克隆为目的重组质粒（见图１（ｂ））．图１中酶切出现１ｋｂ左右的条带，说明获得了Ｒｅｆ－１编码片段．测序结果表明，ｐＧＥＸ－４Ｔ－３／Ｒｅｆ－１质粒构建正确，读码框无移码，无碱基错配．１：ｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔⅡＳＫ（＋）质粒；２－４：ｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔⅡＳＫ（＋）／Ｒｅｆ－１质粒５：ｐＧＥＸ－４Ｔ－３质粒；６－８：ｐＧＥＸ－４Ｔ－３／Ｒｅｆ－１质粒 （ａ）ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａⅠ双酶切（ｂ）ＳａｌⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切图１　质粒酶切鉴定图２．２　ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白的原核诱导表达将ｐＧＥＸ－４Ｔ－３／Ｒｅｆ－１质粒转入ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株，ＩＰＴＧ诱导表达外源基因．为了能够检测融合蛋白的表达效率及其可溶性，分别取诱导前后的菌体及裂菌后的上清液、沉淀，同时进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，对凝胶进行考马斯亮蓝染色，分析蛋白条带．如图２所示，ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１蛋白得到了有效的表达，２号孔为诱导后蛋白电泳条带，在６５ｋＤ左右出现明显的诱导条带，符合理论预期．并且，ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１蛋白的表达性质基本为可溶性表达，３号孔为上清液样品，可发现其中含有大量的ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白．这些证据表明ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１原核表达成功，并且基本为可溶性表达，极有利于下一步的纯化操作及后续研究．Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：诱导前；２：诱导后；３：上清液；４：沉淀图２　ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白诱导表达图４浙江师范大学学报（自然科学版） ２０１１年　２．３　ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白的亲和纯化采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶４Ｂ珠子亲和富集ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白，再用１０ｍｍｏｌ／Ｌ还原型谷胱甘肽洗脱ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白，分别流洗４次，每个批次的洗脱液取１０μＬ做ＳＤＳ－ＰＡＧＥ染色，如图３所示，ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白得到了有效的亲和纯化，并以第２次流洗的效率最高．Ｓｃｉｅｎｃｅｌａｂ软件灰度扫描，得出纯化蛋白的纯度为９２％．对纯化的ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白进行透析去除谷胱甘肽，ＰＥＧ８０００浓缩后加甘油冻存于－８０℃冰箱中．为了计算融合蛋白的诱导效率及亲和纯化的Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：第１次洗脱；２：第２次洗脱；３：第３次洗脱；４：第４次洗脱图３　ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白亲和纯化后产物的电泳图蛋白得率，实验中对每次保留的蛋白都进行了ＢＣＡ法蛋白定量．首先通过Ｓｃｉｅｎｃｅｌａｂ软件灰度扫描分析，得出诱导后ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白占菌体蛋白的比率为２１．５％．再经ＢＣＡ法蛋白定量，得出经亲和纯化浓缩后的ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白占诱导后原始菌体的比率为６．８％，占超声裂解后上清液中蛋白的比率为１１．７％．２．４　蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）检测蛋白质印迹检测验证ＧＳＴ融合蛋白是否为表达序列正确的Ｒｅｆ－１蛋白．如图４所示，只有ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１条带位置能检测到强化学发光信号，而对照ＧＳＴ条带无发光信号．表明ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１原核表达质粒能够正确表达Ｒｅｆ－１融合蛋白，具有良好的抗原性． （ａ）考马斯亮蓝染色（ｂ）抗Ｒｅｆ－１抗体蛋白质印迹检测图４　ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白纯化终产物ＰＡＧＥ考马斯亮蓝染色及蛋白质印迹检测５　第３期 丁正中，等：氧化还原因子－１的原核表达纯化及其活性鉴定２．５　ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１蛋白活性的检测许多转录因子受到Ｒｅｆ－１氧化还原调控，如ＡＰ－１，ＮＦκＢ，ＣＲＥＢ，ＡＴＦ，ＮＦ－Ｙ和ｐ５３等，Ｒｅｆ－１能直接增强转录因子的ＤＮＡ结合能力．为了验证ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白是否具备活性，通过凝胶阻滞实验对其氧化还原酶活性进行了检测．结果如图５所示：ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１直接增强了ＡＰ－１与靶ＤＮＡ的结合量，而ＧＳＴ蛋白本身对ＡＰ－１的ＤＮＡ结合能力无影响，表明ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白能增强ＡＰ－１的ＤＮＡ结合能力；同时，Ｈ２Ｏ２抑制了ＡＰ－１与探针的结合，但同时加入ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１蛋白能部分恢复ＡＰ－１的ＤＮＡ结合活性．表明ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白具有氧化酶活性．图５　凝胶阻滞法检测ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１ 融合蛋白氧化还原酶活性３　讨　论本实验采用ｐＧＥＸ－４Ｔ－３载体系统，通过ＩＰＴＧ诱导表达，获得了ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白的可溶性表达，并进行了亲和纯化，蛋白在菌体中未出现明显的降解．该系统有利于ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白的可溶性表达与亲和纯化，纯化条件温和、步骤简单，同时能极大限度地保持融合蛋白的空间结构和免疫原性，有利于下一步实验操作．本实验所获得的ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白，可用于抗体制备，利用ＧＳＴｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ实验揭示Ｒｅｆ－１互作蛋白，筛选Ｒｅｆ－１蛋白抑制剂．Ｒｅｆ－１是重要的抗氧化基因，亦是重要的肿瘤耐药基因．Ｒｅｆ－１具有ＡＰ内切酶活性，可修复放射、烷化剂、氧化应激造成的ＤＮＡ损伤；同时其所具有的氧化还原酶活性能调控大量转录因子的活性，上调Ｂｃｌ－２等抗凋亡基因的表达．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等［１１］首先发现，在宫颈癌、睾丸癌中Ｒｅｆ－１过表达可增强其对博来霉素和射线的抵抗．Ｆｉｓｈｅｌ等［１２］研究发现，Ｒｅｆ－１在卵巢肿瘤中高表达，如利用ｓｉＲＮＡ技术将其沉默掉，肿瘤体积明显缩小，细胞增殖减慢，阻滞于细胞周期Ｓ期．王东研究组［１３］构建了Ｒｅｆ－１的ＲＮＡｉ质粒，转染骨肉瘤细胞系９９０１，发现抑制Ｒｅｆ－１表达能够下调血管来源的生长因子（ＶＥＧＦ）表达，抑制肿瘤微血管的形成，同时提高了骨肉瘤细胞放疗的敏感性．Ｒｅｆ－１还能诱导肿瘤细胞的多药耐药性．近期研究发现，Ｒｅｆ－１调控转录因子ＹＢ－１，从而诱导多药耐药基因ＭＤＲ１的表达［１４］．ＭＤＲ１基因编码跨膜蛋白Ｐ－糖蛋白，Ｐ－糖蛋白为药物泵，通过三磷酸腺苷（ＡＴＰ）提供能量，可将药物泵出细胞外，使其细胞毒作用减弱直至丧失，出现耐药现象．因此，Ｒｅｆ－１是肿瘤治疗的重要靶向分子．研究者开发了多种药物试图封闭Ｒｅｆ－１的表达或活性［１５－１７］．第１类为ＡＰ内切酶活性抑制剂，主要有７－硝基吲哚－２－甲酸、ＣＲＴ００４４８７６、硫蒽酮和甲氧胺；第２类为氧化还原酶活性抑制剂，如Ｅ３３３０和白藜芦醇，此类抑制剂往往同时抑制活性氧通路及ＮＦκＢ的活化，效应相对较广；第３类则是能够抑制Ｒｅｆ－１表达的化学物质，如大豆异黄酮．本实验表达的ＧＳＴ－Ｒｅｆ－１融合蛋白，经体外凝胶阻滞实验发现具有氧化酶活性，能直接增强ＡＰ－１的ＤＮＡ结合能力，并能抑制Ｈ２Ｏ２对ＡＰ－１蛋白的损伤．如何构建合适的药物筛选体系，检验药物对Ｒｅｆ－１ＡＰ内切酶及氧化还原酶活性的影响，将是一个有意义的研究方向．６浙江师范大学学报（自然科学版） ２０１１年　参考文献：［１］ＦｉｓｈｅｌＭＬ，ＫｅｌｌｅｙＭＲ．ＴｈｅＤＮＡｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｐｒｏｔｅｉｎＡｐｅ１／Ｒｅｆ－１ａｓａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｄｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｔａｒｇｅｔ［Ｊ］．ＭｏｌＡｓｐｅｃｔｓＭｅｄ，２００７，２８（３／４）：３７５－３９５．［２］ＢｏｂｏｌａＭＳ，ＦｉｎｎＬＳ，ＥｌｌｅｎｂｏｇｅｎＲＧ，ｅｔａｌ．Ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄｃｈｅｍｏ－ｔｈｅｒａｐｙｉｎｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａａｎｄｐｒｉｍｉｔｉｖｅｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００５，１１（２０）：７４０５－７４１４．［３］ＺｈａｎｇＹｉｎｇ，ＷａｎｇＪｉａｎ，ＸｉａｎｇＤｅｂｉｎｇ，ｅｔａｌ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ－１／ｒｅｄｏｘｆａｃｔｏｒ－１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１）ｉｎｈｕｍａｎｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒａｎｄｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ［Ｊ］．ＩｎｔＪＯｎｃｏｌ，２００９，３５（５）：１０６９－１０７９．［４］熊光苏，吴叔明，徐晓晶，等．吉西他滨对人胰腺癌Ｐａｔｕ－８９８８细胞株ＡＰＥ／Ｒｅｆ－１的诱导作用［Ｊ］．世界华人消化杂志，２００７，１５（１２）：１４２５－１４２８．［５］ＢｈａｋａｔＫＫ，ＭａｎｔｈａＡＫ，ＭｉｔｒａＳ．ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｍａｍｍａｌｉａｎＡＰ－ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１），ａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｕｌｔｉｆｕｎｃ－ｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．ＡｎｔｉｏｘｉｄＲｅｄｏｘＳｉｇｎａｌ，２００９，１１（３）：６２１－６３８．［６］ＪｉａｎｇＹ，ＺｈｏｕＳ，ＳａｎｄｕｓｋｙＧＥ，ｅｔａｌ．ＲｅｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＮＡｒｅｐａｉｒａｎｄｒｅｄｏｘｓｉｇｎａｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１ｉｍｐａｉｒｓｈｕｍａｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｃｅｌｌｃｙｃｌｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＩｎｖｅｓｔ，２０１０，２８（９）：８８５－８９５．［７］ＷａｎｇＤｏｎｇ，ＬｕｏＭｅｉｈｕａ，ＫｅｌｌｅｙＭＲ．Ｈｕｍａｎａｐｕｒｉｎｉｃｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ１（ＡＰＥ１）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ：ｅｎ－ｈａｎｃｅｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｔｏＤＮＡｄａｍａｇｉｎｇａｇｅｎｔｓｕｓｉｎｇｓｉｌｅｎｃｉｎｇＲＮＡＡＰＥ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ，２００４，３（６）：６７９－６８６．［８］陈连生，王东，张云嵩，等．ＤＮＡ损伤修复基因ＡＰＥ１表达与非小细胞肺癌术后治疗及预后关系的研究［Ｊ］．重庆医学，２００７，３６（１９）：１９１５－１９１７．［９］ＭｅｒｌｕｚｚｉＳ，ＭｏｒｅｔｔｉＭ，ＡｌｔａｍｕｒａＳ，ｅｔａｌ．ＣＤ４０ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｓＰａｘ５／ＢＳＡＰａｎｄＥＢＦａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａＡＰＥ／Ｒｅｆ－１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｄｏｘｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４，２７９（３）：１７７７－１７８６．［１０］耿燕，李涛，胡晓青，等．氧化还原因子１促进乳鼠心肌成纤维细胞增殖［Ｊ］．北京大学学报：医学版，２００９，４１（３）：３３５－３４２．［１１］ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＫＡ，ＢｕｌｌｏｃｋＨＡ，ＸｕＹ，ｅｔａｌ．ＡｌｔｅｒｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｐｅ１／ｒｅｆ－１ｉｎｇｅｒｍｃｅｌｌｔｕｍｏｒｓａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮＴ２ｃｅｌｌｓｃｏｎｆｅｒｓｒｅｓｉｓｔ－ａｎｃｅｔｏｂｌｅｏｍｙｃｉｎａｎｄｒａｄｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００１，６１（５）：２２２０－２２２５．［１２］ＦｉｓｈｅｌＭＬ，ＨｅＹ，ＲｅｅｄＡＭ，ｅｔａｌ．ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆｔｈｅＤＮＡｒｅｐａｉｒａｎｄｒｅｄｏｘｓｉｇｎａｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＡｐｅ１／Ｒｅｆ－１ｂｌｏｃｋｓｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌａｎｄｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＤＮＡＲｅｐａｉｒ，２００８，７（２）：１７７－１８６．［１３］ＷａｎｇＤｏｎｇ，ＺｈｏｎｇＺｈａｏｙａｎｇ，ＬｉＭｅｎｇｘｉａ，ｅｔａｌ．Ｖｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄＡｐｅ１ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｓｔｏｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ，２００７，９８（１２）：１９９３－２００１．［１４］ＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙＲ，ＤａｓＳ，ＭａｉｔｉＡＫ，ｅｔａｌ．ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｏｆｈｕｍａｎＡＰ－ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１）ｉｎＹＢ－１－ｍｅｄｉａｔｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅＭＤＲ１［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００８，２８（２３）：７０６６－７０８０．［１５］ＢａｐａｔＡ，ＦｉｓｈｅｌＭＬ，ＫｅｌｌｅｙＭＲ．Ｇｏｉｎｇａｐｅａｓａｎａｐｐｒｏａｃｈｔｏｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ［Ｊ］．ＡｎｔｉｏｘｉｄＲｅｄｏｘＳｉｇｎａｌ，２００９，１１（３）：６５１－６６８．［１６］ＲｅｅｄＡＭ，ＦｉｓｈｅｌＭＬ，ＫｅｌｌｅｙＭＲ．Ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｔｈｅａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｉｓｔｉｎｇｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓａｎｄｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦｕｔｕｒｅＯｎｃｏｌ，２００９，５（５）：７１３－７２６．［１７］ＬｕｏＭ，ＤｅｌａｐｌａｎｅＳ，ＪｉａｎｇＡ，ｅｔａｌ．ＲｏｌｅｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＤＮＡｒｅｐａｉｒａｎｄｒｅｄｏｘｓｉｇｎａｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＡｐｅ１／Ｒｅｆ－１ｉｎｃａｎｃｅｒａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ：ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｄｏｘｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＡｐｅ１［Ｊ］．ＡｎｔｉｏｘｉｄＲｅｄｏｘＳｉｇｎａｌ，２００８，１０（１１）：１８５３－１８６７．（责任编辑　薛　荣）７　第３期 丁正中，等：氧化还原因子－１的原核表达纯化及其活性鉴定。

超声波辅助提取生姜中姜辣素的工艺研究杜秋叶;李赫;蔡成岗;毛建卫;刘霞;平丽娟;吴啸【摘要】对生姜中姜辣素的提取工艺进行了优化，确定了超声波提取生姜中姜辣素的料液比、提取温度和提取时间。

结果表明，以无水乙醇为溶剂进行提取时，料液比为1：16、温度为60℃，提取时间为20 min时姜辣素提取率最高，正交试验结果表明，最佳工艺为：料液比1：16，超声波处理温度60℃，处理时间30 min。

在最优条件下姜辣素提取液浓度为16.1μg/mL，提取率为25.8％。

%Extraction conditions of the total gingerol in ginger by ultrasonic method were studied , the factors of sample liquid ratio , extraction time and temperature were optimized by single factor and orthonal experiments.The results showed that the optimal parameters of sample liqui d ratio , extraction time and temperature were of 1:16 , 60 ℃ and 20 min, respectively.The orthonal results showed that the optimal sample liquid ratio , extraction time and temperature were of 1:16, 60℃and 30 min, and the gingerol concentration was of 16.1μg/mL with the extraction rate of 25.8%.【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2014(000)015【总页数】3页(P73-75)【关键词】姜辣素;超声波提取;工艺优化【作者】杜秋叶;李赫;蔡成岗;毛建卫;刘霞;平丽娟;吴啸【作者单位】浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310015;浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310015;浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310015; 浙江省农副产品生物技术重点实验室，浙江科技学院，浙江杭州 310023;浙江省农副产品生物技术重点实验室，浙江科技学院，浙江杭州310023;浙江师范大学生化学院，浙江金华 321004;浙江省农副产品生物技术重点实验室，浙江科技学院，浙江杭州310023;浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310015【正文语种】中文【中图分类】TS202生姜含有100 多种成分，主要可分为姜辣素、挥发油和二苯基庚烷3 大类，此外还含有多种氨基酸、维生素和铁、铜、锰、锌、铬、镍、锗等微量元素。

从语言的直接效果角度对比《推销员之死》第一幕的两个中译本作者：袁岚贞黄婷婷来源：《青年文学家》2013年第16期摘要：戏剧翻译具有双重性，除了作为文化作品外，还需考虑它作为演出剧本的一面。

本文以《推销员之死》第一幕的两个中译本为例，分析了英若诚和姚克两个译者在处理语言的直接效果方面的异同，指出戏剧翻译需要多方考虑以满足戏剧表演的特殊需求。

关键词：语言的直接效果；《推销员之死》；翻译作者简介：袁岚贞（1992-），女，浙江人，浙江师范大学外国语学院英语专业2010级学生。

黄婷婷（1992-），女，浙江人，浙江师范大学生化学院生物专业2010级学生。

[中图分类号]：H059 [文献标识码]：A[文章编号]：1002-2139（2013）-16--01一、引言话剧和小说、诗歌、散文等虽同属语言艺术，但若从语体上区分，后者是书面语言艺术，而话剧则是口语语言艺术。

话剧台词主要由对话和独白组成，所有这些都需要演员在表演过程中说出来，高度口语化是话剧语言最显著的特点（王东旭，2010）。

英若诚在《英若诚名剧译丛》的序言中明确提出了话剧翻译的基本原则：语言的直接效果，可分为口语化和简练，语言的动作性两方面。

本文从这两方面比较英若诚和姚克翻译的《推销员之死》第一幕，以下简称英译和姚译。

二、口语化和简练戏剧语言的口语化，指的是在创作中使用经过艺术加工的生活语言。

英若诚将其总结为“活的语言”和“脆的语言”。

（一）活的语言“活的语言”是指演员将以文字形式呈现的话语以其富有感情色彩的声音（包括音调、语气等）传递给观众，使原来静止不动的文字转换成流动的音波（张爽赵凌宇，2009）。

例1 If old man Wagner was alive i'd a been in charge of New York now！要是老头子瓦格纳还活着，纽约这一摊早归我负责了！（英译）要是老瓦格纳还活着，我现在该做纽约的主任了。

（姚译）例2 You want a job？你想找个差事吗？（英译）你要一份工作吗？（姚译）说话人与其使用的语体关系是相对固定的，由出生时期、地点、阶层及所从事的职业而定，除经过专门训练外，一般不能自由变换（程雨民，1989）。

生物系2007年毕业生升学信息 序号 专业 姓名 升学单位(全称具体到院系) 档案转寄详细地址 1 生物科学 高靖 华东师范大学生命科学学院 上海中山北路3663号 华东师范大学生命科学学院党总支负责人（收）

2 生物科学 李大海 浙江师范大学生化学院 浙江省金华市迎宾大道688号 浙江师范大学研究生学院招生办公室

3 生物科学 刘春生 浙江师范大学生化学院 浙江省金华市迎宾大道688号 浙江师范大学研究生学院招生办公室

4 生物科学 竺朝娜 浙江师范大学生化学院 浙江省金华市迎宾大道688号 浙江师范大学研究生学院招生办公室

5 生物科学 黄伟 中国科技大学生命科学学院 安徽省合肥市四号信箱 生命科学学院 丁丽俐（收）

6 生物科学 王明 南京工业大学制药与生命科学院 南京工业大学研究生招生办公室

7 生物科学 刘晓建 西南大学农学与生物科技学院 重庆市北碚区天生路1号西南大学农学与生物科技学院

8 生物科学 李圣春 西南大学蚕学与生物技术学院 重庆市北碚区天生路1号 西南大学农学与生物技术学院

9 生物科学 王汨 西南大学生命科学学院 重庆市北碚区天生路1号 西南生命科学学院 陈亚飞（收）

10 生物科学 朱文勇 云南大学生命科学学院

11 生物科学 徐旅武 重庆工商大学区域经济研究院 重庆市南岸区学府大道19号 重庆工商大学研究生招生办公室

12 生物科学 李强 重庆大学生物工程学院 重庆市沙坪坝区沙正街174号 重庆大学生物工程学院研究生办公室

13 生物科学 田远明 重庆大学生物工程学院 重庆市沙坪坝区沙正街174号 重庆大学生物工程学院研究生办公室

14 生物科学 张启坤 浙江理工大学 浙江省杭州市下沙高教园区西区 浙江理工大学研究生部

15 生物科学 隋承萍 浙江理工大学 浙江省杭州市下沙高教园区西区 浙江理工大学研究生部

16 生物科学 王芳 浙江理工大学 浙江省杭州市下沙高教园区西区 浙江理工大学研究生部