菌种的保藏与复壮

微生物菌种保藏及复壮5.1. 微生物菌种保藏在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。

微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。

具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。

5.1.1. 蒸馏水悬浮法这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。

好气性细菌和酵母等可用此法保存。

5.1.2. 斜面传代保藏斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。

它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。

但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。

因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。

斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。

此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。

如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。

5.1.3. 矿物油中浸没保藏此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。

特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。

是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。

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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。

需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。

目前常用的菌种保藏方法有以下几种。

1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。

由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。

每隔六个月转管一次。

草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。

如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。

这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。

1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。

一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。

液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。

在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。

液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。

如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。

单元3 菌种保藏与复壮模块1 菌种的保藏在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。

菌种保藏的意义菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。

所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。

其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。

菌种保藏的原理菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。

一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。

一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。

一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1) 经长期保藏后菌种存活健在；(2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。

(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。

一、微生物菌种保藏要求在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本方法：由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。

对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。

世界上最早建立的菌种保藏室捷克微生物学家Frantisek Kral布拉格大学副教授，讲授细菌学和真菌学课程。

1890年，Kral建立了私人细菌学实验室，即KRAL细菌学实验室，同年建立了世界上第一个微生物菌种保藏室，保藏有800多个微生物菌种，相继公布了5个版本的菌种目录。

1911年，去世，二战被毁，原保藏的菌种几经转移，至今已寥寥无几。

菌种的保藏与复苏一、菌种保藏（一）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。

菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。

（二）菌种保藏的原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。

其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。

在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。

在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。

如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。

与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。

（三）菌种保藏的方法本实验室常用菌种保藏方法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。

平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。

此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。

2.甘油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。

甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。

1.简述菌种菌种保藏原理及复壮？
答：大肠杆菌和其它微生物一样,都具有稳定遗传性和变异性。

遗传性可以保证微生物本身特征的相对稳定,即无性繁殖过程中能够保持原有的性状,为菌种保藏提供了有利因此,而变异性,使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变,给菌种保藏带来了困难。

由于存在变异,菌种常出现所谓的退化,主要指理想性状的丧失,从而导致发育缓慢,存活率和产量降低等现象。

菌种保藏工作就是通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段,最大限度地降低菌种的代谢强度,抑制细菌的生长和繁殖。

由于菌种的代谢相对静止,生命活动将处休眠状态,从而可以保藏较长时间。

保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外,还不允许污染任何杂菌,能够长期在研究上应用。

此外,在保存前应确保菌种的单纯性,先分离单菌落后进行鉴定,然后再繁殖保存。

菌种保藏和复苏-精简版菌种的保藏与复苏⼀、菌种保藏（⼀）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微⽣物菌种⽤各种适宜的⽅法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。

菌种保藏有许多的⽅法，其共同的⽬标是把菌株的优良性状保存下来，防⽌退化、死亡或杂菌污染。

（⼆）菌种保藏的原理微⽣物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微⽣物的代谢处于最不活跃或相对静⽌的状态，才能在⼀定的时间内使其不发⽣变异⽽⼜保持⽣活能⼒。

低温、⼲燥和隔绝空⽓是使微⽣物代谢能⼒降低的重要因素，所以，菌种保藏⽅法虽多，但⼤都是根据这三个因素⽽设计的。

其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常⽤的⼀种简单易⾏的⽅法。

在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。

在缓慢冷冻时，胞外基质⼀般较快结冰⽽形成冰晶使基质浓度增⾼，造成细胞⽔分外渗⽽⼤量脱⽔，可能使细胞死亡。

如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较⼩，对细胞及原⽣质膜的损伤也较⼩，菌株不易死亡，影响也较⼩。

与低温相关的保藏⽅法，如冷冻⼲燥法、超低温保藏法等，都是利⽤低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理⽽设计的。

（三）菌种保藏的⽅法本实验室常⽤菌种保藏⽅法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌⽣长充分以后，转移⾄4°C冰箱中保存。

平板在4°C存放时，最好⽤封⼝膜封⼝，不能长时间存放，⼀般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。

此法仅⽤于⼯作⽤菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。

2.⽢油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利⽤10-15%的⽢油进⾏冻存。

⽢油的作⽤：⽢油能够提⾼⽔体的粘稠度，使其冰点提⾼，防⽌细胞内部产⽣冰晶造成细胞的损害，⼀般使⽤⽢油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产⽣毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议⽢油终浓度为8-10%，⽢油浓度太⾼会导致质粒的不稳定。