原位细胞凋亡检测改良方法的比较

细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持机体内稳态、发育和疾病发生中起着重要作用。

因此，准确、可靠地检测细胞凋亡是细胞生物学和生物医学研究中的重要课题。

本文将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法，希望能为相关研究提供一些参考。

首先，细胞凋亡的形态学特征是细胞体积缩小、细胞核浓缩、细胞膜破裂和细胞内出现凋亡小体等。

因此，通过显微镜观察细胞形态变化是最直观的方法之一。

在实验中，可以使用荧光染料（如荧光素酶、荧光素酶底物等）标记细胞核和细胞膜，然后观察细胞形态的改变。

这种方法简单直观，但不够精确，需要结合其他方法进行验证。

其次，细胞凋亡过程中，细胞内的DNA发生断裂和片段化，产生特征性的DNA ladder。

因此，DNA ladder检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。

实验中，可以通过DNA提取、电泳等技术，检测细胞内DNA的片段化情况。

这种方法对于凋亡细胞的检测比较准确，但需要较多的细胞样本和专业的实验操作技术。

另外，细胞凋亡过程中，细胞膜上的磷脂会外翻，暴露磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞表面。

因此，PS外露检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。

实验中，可以使用PS结合蛋白标记或荧光染料标记PS，然后通过流式细胞术或显微镜观察PS的表达情况。

这种方法对于凋亡细胞的检测比较灵敏，但需要较为昂贵的试剂和设备。

最后，细胞凋亡过程中，细胞内的一些蛋白酶活性会发生改变，如半胱氨酸蛋白酶（caspase）的活化。

因此，caspase活性检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。

实验中，可以使用荧光染料标记caspase活性底物，然后通过荧光显微镜或流式细胞仪检测caspase的活化情况。

这种方法可以直接反映细胞内凋亡信号通路的活性，但需要较为复杂的实验操作和数据分析。

综上所述，细胞凋亡的检测方法多种多样，各有优缺点。

在实际研究中，可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行细胞凋亡检测。

希望本文介绍的方法能够为相关研究提供一些帮助，推动细胞凋亡机制的深入研究，为疾病的防治提供新的思路和方法。

Modern Practical Medicine,June 2010,Vol.22,No.6・642・穿刺血肿进行抽吸，对脑组织的损伤小，而且大多数患者均能在局部麻醉下进行，术后恢复较快。

并且该手术强调和重视血肿液化术，通过引流管注入尿激酶，促进血肿液化，并通过引流管排出[7]。

本研究结果显示，两组病死率差异无统计学意义，但在存活患者中，颅骨钻孔血肿清除引流术组生存质量却明显优于小骨窗开颅血肿清除术组，这可能就与该术式对脑组织的损伤较少有关。

颅骨钻孔血肿清除引流术是在非直视下进行，也有它的局限性。

（1）发病6h 内患者由于发病时间短，血肿可能尚不稳定，凝固不完全，手术可能诱发继续出血或再出血，故不主张超早期手术。

（2）术中若引流出新鲜血液，说明脑出血在继续，应停止抽吸，向血肿腔内反复注入含有巴曲酶、血凝酶或0.05%肾上腺素液的0℃～4℃的0.9%氯化钠溶液。

（3）因引流时间较长，并且得反复注入尿激酶，故每次操作均需强调无菌原则，以减少颅内感染。

参考文献：[1]Riggs JE,Libell DP,Broos CE,et al.Im-pact of institution of astroke progeam upon referral bias at a rural academic medical center [J ].J Rural Health,2005,21(3):269-271.[2]王忠诚.王忠诚神经外科学[M ].2版.武汉:湖北科学技术出版社,2004:870.[3]Varon J.Diagnosis and management of labile blood pressure during acute cere-brovascular accidents and other hyerten-sive crises [J ].Am J Emerg Med,2007,25(8):949-959.[4]毛群,勾俊龙,刘宗惠.外科治疗脑出血:回顾与展望[J ].国外医学:神经病学神经外科学分册,2003,30(5):420-423.[5]Labato RD,Sarabia R,Cordobes F,et al.Posttraumatic cerebral beraispheric swel-ling Analysis of 55cases studied with computerized tomography [J ].J Neumsurg,1988,68(2):417.[6]翟勇,夏冰.高血压脑出血外科治疗时机及术式选择[J ].医学综述,2008,14（1）:110-111.[7]刘金龙，牛朝诗,高血压脑出血外科治疗进展[J ].立体定向和功能性神经外科杂志,2006,19(6):379-381.收稿日期：2009-11-12（责任编辑：钟美春）原位细胞凋亡技术TUNEL 法的改进夏朝霞，何向蕾【摘要】目的探索原位末端转移酶标技术（TUNEL ）中荧光标记与酶联显色两种方法的关联。

细胞凋亡的几种检测方法Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。

凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。

如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。

此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。

但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。

核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。

用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。

TUNEL法原位检测凋亡细胞的某些改进第22卷第3期2001年7月武汉大学学报(医学版)/’Sed/ealJoumalofW诅nUrd*~ersityV ol22.No3Jtt[y.2001TUNEL法原位检测凋亡细胞的某些改进王乔曾庆云丁成萦徐明口宗文刘维新武汉大学医学院人体解剖学教研室,武汉430071摘要目的:探索避免TUNEL法检测凋亡细胞出现的假阳性和消除非特异性反应的方法.方法:脑和心肌组织石蜡切片.改进的’nJNEt染色选用多聚甲醛固定,蛋白酶K修复抗原,将H封闭内源性过氧化物酶放在反应液标记DNA片段之后,先后用小牛血清或羊血清两次封闭非特异性反应.结果:证实本实验方法避免了假阳性.背底十分清亮.结论:改进后的1”UNEL方法适用于凋亡细胞的检测.主厦词细胞凋亡;免疫组织化学:方法中固分类号R3613细胞凋亡(Apoptosis)是因生理性或病理性刺激引起的一种受基因调控的自身程序性细胞死亡.细胞凋亡不仅在生物体发育过程中与细胞增殖,分化保持动态平衡以维持机体结构和功能的正常,而且细胞凋亡的异常可能是艾滋病,老年性痴呆等神经退变性疾病,缺血性损伤,肿瘤和自身免疫性疾病的重要发病机制.因此,细胞凋亡检测技术可广泛应用于实验研究和临床检验,目前正倍受关注.近年来,我们应用脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)介导的核苷酸(dtrre)缺口末端标记法(TUNEL)对缺血再灌注损伤的脑组织和心肌组织的细胞凋亡进行了研究,并且在TUNEL染色过程中如何避免假阳性,消除非特异性反应,降低背底颜色等方面进行了探索和改进,获得了满意的实验结果,现报道如下.阻断内源性过氧化物酶,室温,10min.0.01mol/LPBS(pH7.4)洗5minx3次.切片滴加20%羊血清,3%dx牛血清白蛋白及1%封阻剂,37℃,15min,再次封闭非特异性反应.切片滴加1:2稀释的POD(HRP连结的抗荧光素抗体)20l,置湿盒内.37,30min进行免疫反应,扩大信号.0.Olrnol/LPBS(pH74)洗5rainx3次.镜控下,DAB.O2显色.胞核呈深棕色即用自来水流水冲洗终断反应.苏木精复染.梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片.1.3实验切片分组I组:按本实验改进的方法进行TUNEL染色.lI组:染色方法同I组.但只用小牛血清一次封闭非特异性反应.III组:按实验试剂盒常规方法进行染色.1材料和方法2结果1.1实验材料SD大鼠缺血30min再灌48h的脑组织或缺血30min再灌注2h的心肌组织.4%多聚甲醛灌注(脑)固定或浸泡(心肌)固定.常规石蜡包埋,切片.1.2TUNEL染色参考宝灵曼公司的细胞凋亡检测药盒并按本实验改进的方法操作.切片脱蜡入水,切片滴加蛋白酶K(20g/m1),37℃,15min,修复抗原.O.01mot/LeBs(pH7.4)洗3mlnx3次.滴加20%小牛血清和3%小牛血清白蛋白,37℃,l5n.封闭非特异性反应.滴加反应液加l(咐r2l,荧光素连接的核苷酸混合缓冲液l81)置湿盒内,37 ℃,lh.对照片不加.0.01mol/LPBS(DH7.4)洗5mJnx3次.在DNA片段标记后,用0.3%H,缺血再灌注的海马,小脑及心室肌细胞都可见呈深棕色的阳性细胞核,染色质凝聚,浓缩,呈凋亡细胞的形态学征象.部分阳性细胞核染色质仍很疏松.I组阳性细胞较少,胞浆及细胞外间质,胶原纤维等不着色,背景十分清亮.II组阳性细胞也较少,但背底颜色较深.ⅡI组阳性细胞多,背底颜色深,呈棕色反应.未加Tcrr的对照片呈阴性.3讨论TUNEL法是一种分子生物学与免疫组织化学相结合原位检测凋亡细胞DNA片段的方法,因其灵敏可靠而被广泛用于细胞凋亡的研究.其基本原理是:细胞凋亡时.核酸内切酶祷激活.染色质或DNA武汉太学学报(医学皈)第22卷被切割,出现单链或双链缺口,产生与DNA断点相同的3’OH末端,在一定缓冲液体系下脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dm’P)不需要模板标记到缺口3’OH末端,再用免疫细胞化学方法将结合有HRP的抗荧光素抗体与标记后的DNA 断点处的荧光素结合,扩大信号,加人HRP显色底物DAB-02后则呈棕色反应.因而有棕色反应可表明出现DNA断裂的3’OH末端.凋亡已经发生, 即使未出现核染色质凝聚,浓缩的典型征象,亦应视为摘亡细胞.我们用透射电镜观察早期的捅亡细胞的染色质仍很疏松,仅部分凝聚趋边.TUNEL染色一般都是在反应液标记DNA片段之前用阻断内源性过氧化物酶,但有报道H’02会减弱TdT的活性j,并可能打断DNA』,出现新的缺口,导致假阳性.因而我们用tt20:阻断内源性过氧化物酶是放在DNA片段标记之后,既可阻断内源性过氧化物酶与显色底物DAB.O2反应致使背底颜色过深,也可避免出现假阳性.我们改进的TUNEL染色背底十分清亮,亦可能与先后用小牛血清或羊血清加封阻剂两次封闭非特异性反应有关.TdT是由小牛胸腺细胞提取的,HRP标记的抗荧光素抗体则为绵羊的G.为了避免混杂有不纯抗体或天然抗体引起的非特异性反应,因而先后用相应的正常血清封闭.白蛋白可封闭醛固定后的醛基.组织最好采用4%多聚甲醛灌注固定为妒.亦可用4%多聚甲醛或10%中性福尔马林浸泡固定.若兼顾电镜标本可用4%多聚甲醛加0.5%戊二醛混合固定.这些固定液固定的组织切片TUNEL染色效果好.固定的组织在包埋前必须充分流水冲洗,去除残留的醛基.醛固定的组织,可发生与蛋白质的交联,掩盖了组织中的部分抗原决定簇.因而,在进行免疫组化反应之前都需要修复抗原.可用酶消化修复或微波修复.用酶消化时若所用酶混有核酸酶活力的酶则使DNA降解造成假阳性.我们用蛋白酶K消化修复抗原,蛋白酶K高度纯化而无核酸酶活力.TUNEL染色的试剂盒价格昂贵,我们在实践中将反应液回收后即时重复使用一次,亦可得到满意效果.参考文献l曾庆云,丁成萦,王乔,等尼莫通对大鼠海马缺血再灌注损伤的保护作用一原位细胞凋亡研究.解剖学杂志,1998. 2l(增刊):2372xuM,z啷QY,Dingc Y,eta1.sluayon日p0pt衄i8inacute i~mieandrepeffu~lratm0/oe~xtium.中国组织化学与细胞化学杂志,000,9(增刊):1223Ml”A,Ata~sioA,8ehifferD.叽1r衄tⅢdetection0f DNAstrandb.abnew-alcellsinsituend-labellingtedl?mq~e8JPatl~l,1995,176(1):274w删肋lit-JookeRR,I~i#erR,elA肿wmethodto如一tenet印叩出镌g髓d-l出出ingd铀嘱?删edD—A.Jt~oebem&Cytoehem,1993.41(1):75Negoe~A,10Ⅱ1ierP,bb吐.MdeIlrF.eta1.Insituapop.协ceeUl~elllngthe』NELmetNxt:impm,~ementatldev.u蚰oncellprel:~iom.J}Iis眦}lem&Cy~oehern,1996,44(9):959(2O00.07.18收稿)TheImprovementAboutiIlSituAl~ptoficCellDetectionbyTUNELMethodWangQi∞,Z酊|gQmg-~n,ⅨIlgClleng-蛐l罟,etalDEmnenlofHulmnA~mmy-Nedic~lcoLLe鲁e,Wuh吼University,Wuh鼬430071,ChinaAI~aetObieet~ve:Toexploreawayofavoidfalsep0siIjvere~ctMtyandolo~ng/1011.specificreactivjtyintheT UNELap.optollcdetectioninsitu,Methods:ThepⅢ曲nsectionsofbrainandmyoeardiumtissueswereslainedbvimpmved‘I1JNELmethod,P0l珊alde}1)TdeWItSchosena8胁ti仰fluid.Pmtein~eKWItSu8edtO他pai 他anti舯.neinhIbI【i∞ofend08∞0I1spelDda8ewith02WItSperformedaftermefldngtheDNAfragmentswithther衄c石vj 竹nujd.B0inese.n1maldll0Ⅱn&Isheepse删mwereusedtoir~ibitthe1301”1一specificreactivityfortwotimes.ResuIts:TheimprovedfIle山odevoided&I暑epositivefeac【ty-a工ldadearbackg∞undw丑sobserved.Conelmion:ThejⅡ1pmvedTUNELstainln只me出.0dc邮beused幻detecttheap0pt0ticoell8.MeSHap0pt08;Ⅱnm0his眦heI1li蝌;method~。

细胞凋亡的检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞生理现象，它在生物发育、组织维持和疾病发展中起着重要的作用。

因此，准确、快速、高效地检测细胞凋亡的发生和程度对于深入理解相关生物学问题至关重要。

目前，已经发展了多种方法来检测细胞凋亡，下面将对其中几种常用的方法进行介绍。

一、形态学方法形态学方法是最早也是最常用的细胞凋亡检测方法之一、通过观察细胞形态和结构的变化来判断细胞是否发生凋亡。

常用的形态学检测方法包括：1.光镜观察：借助光学显微镜观察细胞的形态，发现凋亡细胞的典型特点，如细胞体积缩小、细胞内形成凋亡小体等。

2.电镜观察：通过电子显微镜观察细胞的超微结构，可以观察到凋亡细胞的特征，如凋亡小体形成、核染色质浓缩等。

二、DNA片段化检测方法DNA片段化是细胞凋亡的一个重要特征，因此检测DNA片段化的程度可以作为细胞凋亡的指标之一、目前常用的DNA片段化检测方法包括：1.凝胶电泳：通过DNA凝胶电泳的方式，通过凝胶上DNA片段的迁移速度和大小，可以判断细胞是否发生凋亡。

凋亡细胞的DNA片段通常呈现“梯度”形态，即多条较短的DNA片段。

2. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)：TUNEL法是一种常用的细胞凋亡DNA片段化检测方法。

通过将荧光或酶标记的dUTP引入DNA断裂的末端，然后标记dUTP与断裂末端发生联结，从而实现对凋亡细胞的识别。

三、蛋白质检测方法细胞凋亡相关蛋白质在细胞凋亡过程中发生变化，因此可以通过检测蛋白质表达的变化来判断细胞是否发生凋亡。

1. 蛋白质免疫印迹法（Western blot）：通过将细胞提取物进行电泳分离后，使用特异性的抗体与目标蛋白质结合，然后进行蛋白质的检测和定量，从而判断细胞凋亡的发生。

2.免疫组化：通过使用特异性的抗体与目标蛋白质结合，然后利用荧光染料或酶标记的二抗进行检测，可以观察细胞中凋亡相关蛋白质的定位和表达水平变化。

细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳;二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳,形态学观察透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法,Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等;不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等;三、样品来源不同选择组织：主要用形态学方法HE染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳;四、细胞凋亡检测1、早期检测:1 PS磷脂酰丝氨酸在细胞外膜上的检测2细胞内氧化还原状态改变的检测3细胞色素C的定位检测4 线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测：细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段;对于晚期检测通常有以下方法：1 TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记2 LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测3 Telemerase Detection 端粒酶检测3、生化检测：1典型的生化特征：DNA 片段化2检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记TUNEL等3TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记4通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP 多为dUTP间接或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果;可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测;4、LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少如活体组织切片时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化;通过LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段;此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较;如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成;上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤如机械损伤,紫外线等也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰;需结合其它的方法来检测细胞凋亡;其它方法：1Telemerase Detection 端粒酶检测端粒酶是由RNA和蛋白组成,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”;正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号;研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性;2mRNA水平的检测研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法;据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞cytotoxic T cells 等靶细胞;Bcl-2 和bcl-X 长的作为抗凋亡bcl-2 和bcl-X的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活;用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确;通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X 长的基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测; 5、细胞内氧化还原状态改变的检测：正常状态下,谷光苷肽GSH作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂;细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原;这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除;当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C三羧酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应;6、细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用;正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆,结合Apaf-1 apoptotic protease activating factor-1后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase; 7、线粒体膜电位变化的检测：1线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面;而一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程;3在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变,这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道PT孔道能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡;线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：1若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温,并不导致细胞核的变化;但若将诱导生成PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温,细胞核即开始凋亡变化;2形态学观察,看到细胞数目有限,统计学上的准确性受影响；3凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；4流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化;用于流式细胞仪检测的染料：PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等,其中PI、Hoechst 最常用;PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA或RNA结合;但是PI不能通过正常的细胞膜,Hoechst则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色;正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集; 故PI着色为坏死细胞；亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞;PI和Annexin-V双标：磷脂酰丝氨酸PS正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期或细胞损伤时PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中; Annexin-Vgreen可以和磷脂酰丝氨酸PS特异性结合;因此细胞处于调亡或坏死时,Annexin-V可为阳性早期的坏死细胞可能为阴性;但是只有坏死的细胞PI是阳性五、形态学观察1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察：1用苏木素-伊红HE染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色凋亡细胞,正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2Giemsa染色法、瑞氏染色法等,正常细胞核的色泽均一,凋亡细胞染色变深,坏死细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察：1细胞体积变小,全面皱缩；2凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围;2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩;细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体;3、荧光显微镜常用的荧光染料：丫啶橙、PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区;紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光;1PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用;Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高;DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色;碘化丙啶PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红;因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来;注意事项：细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致;在分析结果时应该注意;六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段;然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180～200bp核小体DNA多聚体;DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色;低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译nick translation,使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞;TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用;过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛digoxigenin-11-dUTP在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合;在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察;毛地黄植物是地高辛的唯一来源;在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低;抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用;本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定;一试剂配制1、磷酸缓冲液PBS：磷酸钠盐50mM,NaCl 200mM;2、蛋白酶K200μg/ml,：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml;3、含2%H2O2的PBS缓冲液：H2O2 ；PBS缓冲液;4、TdT酶缓冲液新鲜配：Trlzma碱3.63g用HCl调节pH至,加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g;5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液76μl,混匀,置于冰上备用;6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17. 4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O 1000ml7、％二氨基联苯DAB溶液：DAB 5mg；PBS 10ml,, 临用前过滤后,加过氧化氢至%;8、％甲基绿：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml;9、100％丁醇,100％、95％、90％、80％和70％乙醇,二甲苯,10％中性甲醛溶液,乙酸,松香水等;10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体ONCOR二实验步骤1、标本预处理：1石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min;用无水乙醇洗两次,每次3min;用95％和75％乙醇各洗一次,每次3min;用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液20ug／ml,于室温水解15min,去除组织蛋白;用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作;2冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min;置乙醇：乙酸2：1的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;3培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5 × 107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min;在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS,于室温反应5min;用PBS洗两次,每次5min;3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液,置室温1～5min;4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应1hr注意：阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液;5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动;6、组织切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min;7、用PBS洗4次,每次5min;8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的％DAB溶液,室温显色3～6min;9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min;10、于室温用甲基绿进行复染10min;用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30s;依同样方法再用100％正丁醇洗三次;11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果;三注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照;阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松1μM处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞;阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同;一、吖啶橙简称AO荧光染色法原理：吖啶橙Acridine Orange是吖啶的衍生物之一;它是一种荧光染料,激发峰492nm,荧光发射峰530nmDNA,640nmRNA,它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间,而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上;在蓝光给502nm激发下,细胞核发亮绿色荧光约530nm,核仁和胞质RNA发桔红色荧光＞580nm;吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光,但细胞固定阻抑了这种结合,从而主要显示DNA、RNA两种核酸;1试剂AO贮备液：AO 50mg分析纯蒸馏水 50ml4℃冰箱保存4个月;Tris缓冲液：Tris 50mmol/LMgCl2 LKCl 25mmol/LAO工作液：将AO贮备液10:1用蒸馏水稀释,再用Tris缓冲液将AO稀释到μg/ml的终浓度;2操作步骤①取乙醇固定的细胞悬液,浓度为107/ml,1500r/min,5分钟,弃乙醇;②加入2ml AO工作液,室温染10分钟;③滴在载玻片上,加缓冲甘油封片;④在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长530-640nm观察;结果：活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体;二、Hoechst33258染色Hoechst33258为特异性DNA染料,,与A-T键结合,但在环境下则优先与RNA 结合,染色DNA时应调整染液的pH至,这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存;本方法是用于培养细胞、细胞涂片或细胞甩片;试剂及配制1Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg,用20ml蒸馏水溶解后,滤过,4℃避光保存;用时蒸馏水10倍稀释成染色液;2 ,;3封片液：20mmol/L柠檬酸,50mmol/L 磷酸氢二钠,50%甘油;4细胞固定液：甲醇/冰乙酸3:1,现配;操作方法1原代细胞培养、细胞学涂片或细胞甩片机制制备的单细胞片;2细胞固定液4℃固定5min;3蒸馏水稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min;4蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体;5封片剂封片后荧光显微镜观察;结果：在荧光显微镜下,活细胞核呈弥散、均匀荧光,坏死细胞不被Hoechst 染色;出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化,如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞;三、甲基绿-派诺宁染色法一原理细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态,但两者发生机制不同;细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程,需要有细胞内蛋白酶的激活,细胞质内常有mRNA表达的增强;而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程,细胞质内常有RNA的损失;根据这一特点,可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性,使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染,如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞,呈阴性染色者为坏死细胞;二试剂及配制1. 组织固定液无水乙醇 600ml氯仿 300ml冰醋酸 100ml2.甲基绿纯化新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫;方法是将2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入氯仿20ml充分,使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色;旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉带比红色的氯仿移去,再加入新的氯仿10ml,如此反复更换氯仿,直到无紫红色为止;该液作为贮存液,4℃保存;3.染色液甲基绿贮存液 5ml5%派诺宁水溶液 1ml蒸馏水 12mlL乙酸钠 18ml临用前配制,滤纸过滤;三操作方法1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h或培养细胞、细胞学甩片固定10min;2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;3.切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水;细胞学涂片不用梯度酒精4.置染色液中室温下染色约1h;5.取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液;6.插入丙酮中迅速分化;7.转入丙酮二甲苯1:1稍洗;8.二甲苯透明2-3次;9.中性树胶封固;四结果光学显微镜下凋亡细胞固缩,细胞核呈绿色或绿蓝色着染,胞质呈红紫色着染,坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染;观察时可用凋亡指数进行计数,即随机选择约10-20个视野每张切片约1000-2500个细胞,计数凋亡细胞百分率;四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术TUNEL原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡;传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成;但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂;凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3ˉ-OH 末端;末端脱氧核糖核酸转移酶Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT可以将地高辛标记的dUTPDIG-dUTP标记至3’-OH末端,DIG-dUTP核苷酸结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体Anti-DIG-Biotin反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶SABC,然后加入显色底物DAB予以显示;凋亡的细胞核呈棕黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞;试剂1.标记缓冲液Labeling Buffer5×浓度的TdT反应缓冲液,含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾;10mmol/L CoCl2 氯化钴1mmol/L DTT二硫苏糖醇2.末端脱氧核糖核酸转移酶TdT,×20×204.封闭液Blocking Reagent5.生物素化抗地高辛抗体×100×100×2008.抗体稀释液9. 多聚赖氨酸或APES;10. 0.01M TBS,配法：1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris和纯乙酸;11. DAB显色试剂;操作步骤1.样品处理1玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理;2细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定;用4%多聚甲醛/0.01M PBS室温下固定30-60分钟;0.01M PBS洗2分钟×2次;蒸馏水洗涤2分钟×2次; 3组织：有条件时应及时固定;常规4%多聚甲醛/0.01M PBS或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋;切片常规脱蜡入水脱蜡务必干净;2.新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟;蒸馏水洗涤2分钟×3次;3.标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化5-15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次;细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟;新鲜石蜡切片消化5-10分钟;陈旧石蜡切片消化10-30分钟;4.标本片加标记缓冲液Labeling Buffer20μl/片,以保持切片湿润;按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl,加入18μl标记缓冲液中,混匀;甩去切片上多余液体后加标记液,20μl/片;置样品于湿盒中,37℃标记2小时;5.0.01M TBS洗2分钟×3次;6.加封闭液50μl/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗;7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体：取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl,混匀后50μl/片加至标本片上;置样品于湿盒中,37℃反应30分钟;0.01M TBS洗2分钟×3次;8.用抗体稀释液1:100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC10μl,混匀后50μl/片加至切片;37℃反应30分钟;0.01M TBS洗5分钟×4次;显色;10.苏木素轻度复染;脱水,透明,封片;显微镜观察;结果判定细胞核固缩有的呈碎片状,不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞; 即凋亡的细胞TUNEL改良方法在细胞凋亡检测中的应用.0M枸橼酸盐缓冲液、通透液%Triton-100、枸橼酸钠、标记缓冲液：二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇L,氯化钴coci;TdT反应液；标记缓冲液中加TdT酶100U/ml,biotin-dUTP；链霉菌素标记的辣根过氧化物酶,蛋白酶K20μg/ml;显色剂氨乙基咔唑amino ethyl carbazole,AEC的配制AEC 20mg二甲酰胺DMF0.05M醋酸缓冲液 50ml%H2O2实验步骤1切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟,PBS漂洗3×5分钟；23%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟；3组织切片浸泡于盛有L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置于微波炉内,在650W,辐射时间15min的条件下进行组织处理;冷却至室温;4放在通透液%Triton -100溶于%枸橼酸钠溶液中室温20分钟,PBS漂洗3×5分钟；5滴加50μl TdT反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；6滴加50μl biotin-dUTP,反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；7滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟,8PBS漂洗3×5分钟, AEC-H2O2显色10-15分钟,苏木素复染用1%的酸性水分化,水洗、水溶性封片;阳性对照dTd 反应前用20μg/ml蛋白酶K处理切片;阴性对照用PBS代替dTd反应液; 结果判断及标准改良的方法：凋亡细胞核呈红色固缩,有白边集或碎列,细胞膜皱褶,有的卷曲和出泡,在计数时避开坏死区域,以避免假阳性;计数500个细胞中的凋亡细胞数目,得出凋亡百分率;凋亡染色分度如下：每个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级；3-6个为Ⅱ级；6-10个为Ⅲ级；>10个者为IV级;阳性对照：经在dTd反应认前用20μg/ml蛋白酶,处理切片30分钟的切片同改良方法基本相同,但红色较浅;阴性对照：切片无棕色反应;评价正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂,没有3’-OH末端被标记,因此镜下无显色的物质;这种分子生物学与形态学相结合的方法,可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记,准确反应细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征,灵敏度远远高于一般的组织化学和生物化学方法;在检测过程中,可设阴性对照不加TdT阳性对照已知的阳性标本;注意:AEC孵育切片,反应产物为红色;可用苏木精对衬染色,反应产物是纯酒精溶性的,因此;可用酸性水溶液分化,然后用水溶性封固剂封片;五、凋亡细胞：凝胶电泳检测前已提及凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂;典型的细胞凋亡,在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段,而非典型的凋亡细胞,由于核内的DNA降解不完全,仅形成300~50kb的DNA大片;利用这一特性,可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况;试剂1. PBS缓冲液2. 消化液的配制：100mmol/L NaCl10mmol/L Tris-HCL25mmol/L EDTA%SDSml蛋白酶K3. 酚：氯仿：异戊醇混合液按25:24:1比例配制;4. 氯仿：异戊醇混合液按24:1比例配制;5. 醋酸铵,L;6. 100%和70%的乙醇;7. TE 缓冲液：100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA;8. TBE缓冲液;9. 电泳仪;。

TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结3. TUNEL实验中几个关键步骤是什么？4. 如何减弱非特异性染色？5. 细胞通透的时间如何选择？6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗？8. DAB的显色时间和条件如何把握？9. 首次做TUNEL实验的注意事项？10. PBS浸洗在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？ 11. 脱蜡和水化在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：1. 充分脱蜡和水化。

脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。

一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3. 适当延长TUNEL反应液的时间。

一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。

4. DAB显色条件的选择。

一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。

5.PBS的充分清洗。

我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。

对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

生物医学中的亚细胞分析技术探究随着科技的不断进步和发展，生物医学领域的亚细胞分析技术也在不断的改进和完善。

这些技术不仅对于人类疾病的治疗和预防有很大的作用，也能够对于生命机理和生物学基础的研究提供有力的支持。

本文将介绍一些常见的亚细胞分析技术，并探究这些技术在生物医学领域的应用和前景。

一、细胞计数分析技术细胞计数分析技术是一种常见的亚细胞分析技术，基于细胞数量的计算和分析。

这种技术通常使用显微镜和细胞计数器等设备来进行，可以帮助科学家了解基础生物学中的一些重要性质，如细胞死亡，增殖和分化等。

在临床医学中，细胞计数分析技术也有着广泛的应用。

例如，在癌症治疗中，医生可以通过检测病人体内的癌细胞数量，以及这些细胞的增殖和死亡率来判断治疗方案的疗效。

此外，这种技术也可以用于监测器官移植的过程，以确保移植后的器官数量和质量符合要求。

二、原位杀死技术原位杀死技术是一种分离和鉴定生物样本中特定亚细胞的常用方法。

这种技术通常使用荧光探针等特殊的标记材料来搜索并杀死特定的细胞，以便进行分析和鉴定。

在生物医学领域，原位杀死技术的应用广泛。

例如，在遗传学中，科学家利用这种技术来研究染色体和基因的属性，以及这些属性在遗传疾病的发病机制中所起的作用。

此外，这种技术还可以用于调查细胞分化和组织发育等方面的基础研究，以及疾病的原因和预防的研究。

三、细胞凋亡分析技术细胞凋亡分析技术是一种监测细胞死亡的方法，可以通过检测DNA损伤，核壳变化，膜的通透性变化等方式来区分细胞的生死状态。

在临床医学领域，细胞凋亡分析技术也有着广泛的应用。

例如，在癌症治疗中，通过利用这种技术来监测化疗药物对于癌细胞的杀伤效果和治疗方案的疗效。

此外，细胞凋亡分析技术还可以用于研究细胞自我调节机制，以及疾病的发生和预防。

四、流式细胞术流式细胞术是一种基于细胞物理和化学性质的鉴定方法，可以对细胞进行高效的分析和排除。

这种方法基于细胞表面分子或化学物质的特异性结合，并通过光学测量将细胞分离。

原位细胞凋亡检测改良方法的比较【摘要】目的:探讨TUNEL法检测细胞凋亡的最佳条件。

方法:利用9例标本45张组织切片进行凋亡检测，分别单纯和组合使用蛋白酶K消化、微波修复和Triton X100前处理方法并作比较。

结果:蛋白酶K合并微波及Triton X100组（+ +）阳性率为89%，蛋白酶K合并微波组（++）阳性率为67%，蛋白酶K合并Triton X100组（+ +）阳性率为44%，单纯蛋白酶K 及微波组（++）阳性率均为11%。

将组合处理组与单纯处理组比较，P<0.01，差异有显著性。

结论:蛋白酶K消化、微波及Triton X100多重组合的检测前处理方法可以明显提高杂交信号阳性敏感度。

【关键词】细胞凋亡；蛋白酶K；微波细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡，是一种受基因控制的主动性细胞自杀过程，肿瘤的发生、发展和转归都与细胞凋亡有密切的关系［1］。

原位凋亡检测是近些年发展起来的细胞凋亡检测技术，目前广泛采用的是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术。

凋亡率的高低与患者预后也有着直接的关系，现已成为评价疗效的重要指标之一［2］。

本文应用蛋白酶K消化、微波、和Triton X100不同的前处理方法，进行凋亡检测的改良和比较，以提高检测阳性率，正确反映机体细胞凋亡的实际水平。

1 材料与方法1.1 主要试剂及设备 Roche公司生产的AP原位细胞凋亡检测试剂盒（Cat.NO. ）；微波炉（ywy 781医用型）。

所用载玻片均用清洁液浸泡24 h以上，自来水、蒸馏水冲洗，95%酒精浸泡擦干，以APES丙酮防脱片处理备用。

1.2 实验分组选取组织标本9例，包括慢性胃炎3例，胃癌3例，食管癌3例，经10%中性甲醛固定24 h，石蜡包埋后每例标本均连续切片6张，厚度4 μm，HE染色一张，余作凋亡染色。

设计蛋白酶K组、微波处理组、蛋白酶合并微波组、蛋白酶合并Triton X100组、蛋白酶合并微波及Triton X100组，每组设阴性对照2张。

综述ＣＨＩＮＡＦＯＲＥＩＧＮＭＥＤＩＣＡＬ勰啊四种细胞凋亡检测方法的比较何雯张蓓刘无逸（上海体育学院上海２００４３８）【摘要】近年来细胞凋亡一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。

本文综述了电镜检测法、Ｉ）ＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测法、流式细胞术和ＴＵＮＥＬ／－去－四种细胞凋亡的检测方法，并对各种方法的优点及局限性做一简要比较。

在选择细胞凋亡检测方法时，要充分了解各种方法的原理和应用范围，进行综合考虑。

多种检测方法的联合应用常可获得更准确的结果。

ｌ关键词】凋亡检测方法Ｉ中图分类号】Ｒ３６１Ｉ文献标识码】ＡＩ文章编号】１６７４—０７４２（２００７）１２（ｂ）一０００１—０２细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）是由基因控制的、高度有序的细胞主动死亡过程，即程序性细胞死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ，ＰＣＤ）。

细胞在一定的生理或病理状态下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，而被其他细胞吞噬，不导致炎症反应。

细胞凋亡不受到外损伤因素直接导致的被动改变而属机体自身的生理活动，是一种基因指导的生物过程，是对外部或内部的死亡信号作出的反应，贯穿从受精、发育、成熟、衰老的整个生命过程。

近年来一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。

随着对凋亡研究的不断深入，各种各样检测凋亡的新技术和新方法相继建立，因此在我们的研究中选择哪种凋亡检测方法非常关键。

本文就细胞凋亡的概况及四种细胞凋亡的检测方法做一下比较，以期为将来的研究打下理论基础。

１细胞凋亡的概况Ｋｅｒｒ等（１９７２年）【１１根据形态学的变化，首先提出和描述］‘一种不同于细胞坏死的死亡方式即细胞凋亡。

细胞凋亡的发生是一个很复杂的过程，基本过程大体可以分为：起始阶段、效应阶段和清除阶段。

它的发生是渐进性分阶段的过程，我们可以对其事件的发生大致排一个先后顺序：首先是凋亡受体的激活或凋亡诱导因子的活化，然后通过不同途径进行传导，按下来是线粒体的变化及其ｃａｓｐａｓｅｓ的活化，这是凋亡的前期事件；接着随着活化核酸内切酶激活，细胞出现凋亡特有的表现：磷脂酰丝氨酸外翻、细胞皱缩、染色质凝集等，直至形成凋亡小体。

常用细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种基本的细胞程序性死亡过程，对于维护正常组织结构和功能发挥重要作用。

因此，准确检测凋亡是研究细胞生物学、药物作用以及疾病发生机制的关键。

以下是几种常用的细胞凋亡检测方法。

1.同步体细胞凋亡分析法同步体细胞凋亡分析法基于DNA片段化的原理，通过载荷量测定等手段评估细胞死亡。

其中，凝胶电泳法可以评估DNA的片段化，而在DNA降解过程中也会释放核酸碱基和低分子量的寡糖，可以通过典型的化学制剂检测其蓄积量。

2.DAPI染色法4',6-二胺-2-苯并咪唑（DAPI）是一种DNA特异性荧光染料，它可以与DNA结合并发射蓝色荧光。

细胞凋亡时，DNA会发生片段化并形成形态特异的核质凝块，称为凝胶体(GC)。

DAPI染色后，健康细胞呈现规则形状的核，而凋亡细胞则呈现出碎裂的DNA染色残基。

3.DNA碎片检测法DNA碎片检测法利用凋亡细胞释放到细胞外的DNA碎片，通过测量DNA浓度的改变以评估细胞凋亡。

可以通过比色法、荧光染料测量或特定酶的检测来定量DNA。

4. Annexin V-PI（propidium iodide）双荧光染色法Annexin V是一种能够选择性结合凋亡细胞的磷脂。

同时，PI可以穿透受损的细胞膜并与细胞核DNA结合。

所以，通过联合使用这两种染料，可以区分正常细胞、凋亡细胞以及坏死细胞。

5. TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）法TUNEL法是一种特异的DNA断裂终端标记法，它能够用于检测细胞死亡领域的DNA片段化。

具体而言，该方法依赖于终端脱氧核苷酸转移酶（TdT），它能够与DNA链上的未配对的碱基发生共价连接。

通过在DNA 链的断裂末端引入二脱氧尿嘧啶三磷酸（dUTP），再使用碱性棕榈酸蓝（APB）进行染色，TUNEL法可以在荧光显微镜下检测出碎片化的DNA。