实验三、鸡胚细胞的原代培养(改进)

实验十一细胞的原代培养一、实验目的1、了解细胞体外培养的原理、基本方法。

2、掌握无菌操作方法及注意事项。

3、学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。

二、实验原理模仿体内生长环境，使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁殖。

三、实验器材1、纯水设备：纯水仪2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器及0.22 m滤膜；3、超净工作台4、培养设备：普通培养箱、CO2培养箱；5、贮存设备：冰箱、液氮罐6、观察设备：倒置显微镜7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等培养主要用品1、培养瓶、皿：以玻璃器皿为主，应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品（1）培养瓶（2）培养皿2、血球计数板3、眼科剪、镊；实验材料7－14日龄鸡胚（肝素）抗凝血原代培养材料选择幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养分化程度低的组织比分化高的容易培养肿瘤组织比正常组织容易培养。

实验试剂1、D’Hanks液KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4•H2O 0.06g，加H2O至1000ml注：Hank’s液可以高压灭菌。

4℃下保存。

2、o．25％胰蛋白酶（D’Hanks液配）3、M199 培养液4、小牛血清5、青、链霉素6、5％NaHCO3、2％碘酒7、75％酒精8、洗液：由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成四、实验方法与步骤一）培养前的准备工作1、用品清洗与消毒2、溶液配制与消毒（1）培养液、酶、抗生素等生物活性成分需过滤消毒（2）平衡盐等高压蒸汽消毒3、预热溶液4、工作间及超净台消毒：紫外线、消毒液。

5、洗手和着装6、进入无菌室7、关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行)将消毒过的所用物品放入超净工作台中组织块培养法培养鸡心肌细胞步骤1、配M199完全培养液：M199基础培养液90％小牛血清10％青霉素100IU/ml链霉素100 g/ml过滤除菌。

细胞生物学实验报告实验三细胞原代培养1引言1.1 实验目的1. 理解细胞原代培养原理。

2. 了解细胞原代培养的应用。

3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。

4. 巩固无菌操作技术。

1.2 实验原理细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

2实验仪器、试剂及操作步骤2.1 实验仪器超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等2.2 实验试剂DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等2.3 实验材料动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚2.4 实验步骤A.鸡胚成纤维细胞的原代培养1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。

2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。

3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。

4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。

5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。

将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋壳。

6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。

7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。

8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。

9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。

10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。

在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组织块接种到培养瓶内。

在培养瓶中放置10-15个组织块。

11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。

鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。

在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。

要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。

组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。

组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。

很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。

细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。

组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。

原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。

本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。

（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。

2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。

3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。

（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。

以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。

2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。

一、实验目的1. 了解鸡胚的发育过程及形态变化；2. 掌握鸡胚培养的基本操作技能；3. 熟悉鸡胚培养在生物科学研究和医学领域的应用。

二、实验原理鸡胚是一种常用的实验动物模型，其胚胎发育过程与哺乳动物胚胎发育过程具有相似性。

通过观察鸡胚的发育过程，可以了解胚胎发育的规律和机制。

鸡胚培养是生物科学研究和医学领域的重要技术手段，可用于病毒分离、疫苗制备、基因功能研究等。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 新鲜鸡蛋- 生理盐水- 灭菌滤纸- 鸡胚培养液- 培养皿- 显微镜- 培养箱- 计时器2. 实验仪器：- 研钵- 研杵- 灭菌镊子- 灭菌剪刀- 灭菌移液器四、实验步骤1. 鸡胚培养液的准备：- 将生理盐水加入研钵中，用研杵搅拌均匀；- 将生理盐水倒入培养皿中，用灭菌滤纸过滤；- 将过滤后的生理盐水倒入培养瓶中，加入鸡胚培养液，充分混合。

2. 鸡胚的收集：- 将鸡蛋放入温水中浸泡，待鸡蛋表面温度与室温相近；- 将鸡蛋敲碎，取出蛋黄和蛋白，弃去；- 将鸡蛋清加入鸡胚培养液中，搅拌均匀。

3. 鸡胚的接种：- 将鸡胚培养液倒入培养皿中，厚度约1cm；- 将鸡胚放入培养皿中，用灭菌镊子轻轻压平；- 将培养皿放入培养箱中，保持适宜的温度和湿度。

4. 鸡胚的观察：- 每日观察鸡胚的发育情况，记录发育过程；- 利用显微镜观察鸡胚的形态变化，如胚胎细胞分裂、器官形成等。

5. 实验结果分析：- 根据观察结果，分析鸡胚的发育规律和机制；- 结合相关文献，探讨鸡胚培养在生物科学研究和医学领域的应用。

五、实验结果1. 鸡胚发育过程：- 鸡胚在培养过程中，细胞分裂迅速，胚胎逐渐形成；- 随着时间的推移，胚胎细胞分化出不同的器官，如心脏、肝脏、肺等。

2. 鸡胚形态变化：- 通过显微镜观察，可见鸡胚细胞分裂、胚胎形成、器官发育等过程；- 鸡胚的形态变化与相关文献描述相符。

六、实验讨论1. 鸡胚培养在生物科学研究和医学领域的应用：- 鸡胚培养可用于病毒分离和疫苗制备；- 鸡胚培养可用于基因功能研究和疾病模型构建；- 鸡胚培养为研究胚胎发育规律和机制提供了有力工具。

鸡胚原代细胞的培养[实验目的]掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序，观察单层细胞生长情况。

[实验材料]9~10日龄鸡胚，Hank`s液（已含0.5%乳蛋白水解物），0.25%胰蛋白酶，NaHCO，双抗，3牛犊血清，手术剪，眼科镊，培养皿，细胞瓶，三角瓶，玻璃珠（置于三角瓶内），漏斗，纱布（置于漏斗中），30ml注射器，10ml注射器，塞子若干，蛋座，水浴锅。

[实验内容及操作程序]1、配液在Hank`s液中加入青、链霉素，使其含量为青霉素1000IU/ml，链霉素100ug/ml。

胰蛋白酶用含有青链霉素的Hank`s液（简称H液）按1:9比例稀释。

用7.5%NaHCO调整pH至7.2~7.4（玫瑰红色）。

32、取胚及剪碎将胚蛋气室端向上竖直于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，注意不能让蛋壳碎屑掉入气势内，撕破卵膜并揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，用镊子夹住或勾住鸡胚脖子部位，取出胚胎于平皿中。

剪去头部、翅爪及内脏，用H 液洗去体表血液。

用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使其成为约1mm3大小的碎块，用H液小心洗涤2次。

3、消化将洗涤好的胚胎碎块转移入三角瓶中，尽量不要让组织块沾到平皿壁上，按组织块量约3~5倍胰酶，加上瓶塞，37℃水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次。

待液体变混而稍稠，中止消化。

4、分散取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后轻轻倒去胰酶，塞好瓶塞，用力振摇三角瓶，以使细胞分散下来。

加入H液，轻轻振荡，待组织块下沉后，通过漏斗中的纱布将H液过滤于细胞瓶中，小心不让组织块一并倒出。

继续用力振摇三角瓶，加H液过滤，重复两次，最后一次连同组织块一起倒入漏斗。

5、加入血清在过滤好的细胞悬液中加入牛犊血清，使血清含量为10%。

塞好瓶塞，轻摇细胞瓶混匀。

6、分装将加入血清的细胞悬液分装至各个细胞瓶中，约占细胞瓶容积的10%左右。

塞紧瓶塞，将细胞瓶横卧，瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养。

4h后细胞可贴附于瓶壁，每隔24h观察一次，24~36h生长成单层细胞，此时可吸取培养液，更换维持液，并接种病毒。

第1篇一、实验目的1. 掌握胚胎培养的基本原理和操作步骤。

2. 学习在体外条件下模拟胚胎发育过程，观察胚胎的形态变化和生长情况。

3. 探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。

二、实验原理胚胎培养是指将受精卵或早期胚胎置于体外的人工培养系统中，模拟体内环境，使其继续发育和生长。

通过胚胎培养，可以研究胚胎发育的规律，筛选优良胚胎，以及进行胚胎基因编辑等。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 受精卵或早期胚胎- 培养基：DMEM/F12、KSR、Hams F12- 胎牛血清（FBS）- 促性腺激素（如hCG）- 透明质酸酶- 胚胎培养皿- 显微镜- CO2培养箱- 移液器- 计时器2. 实验仪器：- 超净工作台- 恒温箱- 高压灭菌器- 电子天平四、实验步骤1. 准备培养基：- 将DMEM/F12、KSR、Hams F12培养基按照说明书比例配制，并加入胎牛血清（FBS）。

- 将培养基在无菌条件下过滤除菌，并分装于培养皿中，备用。

2. 胚胎处理：- 将受精卵或早期胚胎置于超净工作台中，用消毒后的移液器吸取一定量的透明质酸酶，轻轻涂抹在胚胎表面。

- 适当放置一段时间，使透明质酸酶作用于胚胎表面，使其分散成单个细胞。

3. 胚胎培养：- 将处理后的胚胎放入装有培养基的培养皿中，放入CO2培养箱中培养。

- 每天观察胚胎的生长情况，记录胚胎的形态变化和细胞分裂情况。

4. 不同培养条件实验：- 将胚胎分别置于不同浓度的胎牛血清（FBS）培养基中培养，观察胚胎的生长情况。

- 将胚胎置于不同温度、pH值、氧气浓度等条件下培养，观察胚胎的生长情况。

5. 结果记录与分析：- 记录不同培养条件下胚胎的形态变化、细胞分裂情况以及生长速度。

- 对实验结果进行统计分析，探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。

五、实验结果1. 正常培养条件下：- 胚胎在正常培养条件下能够正常发育，细胞分裂速度较快，形态变化明显。

2. 不同胎牛血清（FBS）浓度条件下：- 随着胎牛血清（FBS）浓度的增加，胚胎的生长速度和细胞分裂速度逐渐加快。

一、实验目的1. 了解鸡胚培养的基本原理和操作步骤；2. 掌握鸡胚培养过程中细胞的分离、培养和传代技术；3. 观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。

二、实验原理鸡胚培养是一种在体外培养鸡胚细胞的方法，主要用于研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学等领域。

通过将鸡胚组织中的细胞分离出来，并在特定的培养条件下进行培养，可以观察到细胞的生长、形态和增殖情况，从而研究细胞的生物学特性。

三、实验材料1. 新鲜鸡蛋：选用新鲜鸡蛋，确保蛋壳完整，无破损；2. 实验器材：解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、培养皿、移液枪、培养箱、显微镜等；3. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等；4. 其他：消毒剂、无菌操作台、无菌棉签等。

四、实验步骤1. 鸡胚的获取：将新鲜鸡蛋在37℃温水中浸泡10分钟，使蛋壳软化，然后用解剖刀在鸡蛋的一端切开，取出鸡胚。

2. 鸡胚的解剖：将鸡胚放在解剖盘上，用剪刀剪开卵黄囊，取出卵黄囊膜，用镊子取出鸡胚成纤维细胞。

3. 细胞的分离：将鸡胚成纤维细胞放入装有DMEM培养基的培养皿中，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，然后用移液枪吹打细胞，使细胞分散。

4. 细胞的接种：将分散的细胞接种到培养皿中，放入培养箱中培养。

5. 细胞的观察：在显微镜下观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。

6. 细胞的传代：待细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分离成单个细胞，再进行接种。

五、实验结果1. 鸡胚成纤维细胞在培养过程中，呈扁平梭形，细胞质丰富，细胞核明显。

2. 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大。

3. 在显微镜下观察，细胞形态规则，生长旺盛。

4. 经过传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。

六、实验讨论1. 鸡胚培养过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。

2. 培养基的质量对细胞的生长和增殖有重要影响，需选用优质培养基。

3. 细胞传代次数过多，可能导致细胞生长缓慢、形态发生变化，影响实验结果。

细胞原代培养实验报告引言原代培养是一种将从组织或器官中分离得到的细胞进行体外培养的方法。

它具有重要的科研和临床应用价值。

本实验报告将详细介绍细胞原代培养的步骤、影响因素以及常见问题的解决办法，以及对细胞培养实验的观察结果和分析。

材料与方法1. 实验所用细胞系我们选择了小鼠胚胎纤维细胞（MEF）作为实验所用细胞系。

MEF细胞具有较强的增殖能力和较长的寿命，非常适合原代培养实验。

2. 原代细胞培养基的配制与消毒配制原代细胞培养基的主要成分有： - DMEM培养基 - 胎牛血清（FBS） - 青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）配制原始培养基时要进行严格的消毒操作，以防止细菌和真菌的污染。

3. 细胞分离与传代分离过程1.取出小鼠胚胎。

2.将小鼠胚胎置于无菌PBS中，去除头部和内脏。

3.将净化后的胚胎置于细胞培养基中。

4.用无菌耐热胶管切成碎片，使其均匀分散。

5.加入细胞培养基中的胞外消化液。

6.重复离心和去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。

7.加入预暖的细胞培养基，充分悬浮细胞。

8.继续离心、去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。

传代过程1.收集上述分离得到的细胞悬液。

2.用血细胞计数板计数细胞数目。

3.计算倍增比例，将细胞悬液按比例加入新鲜的细胞培养基中。

4.转移至新的细胞培养瓶中，继续培养。

4. 影响细胞培养的因素4.1 培养基的质量培养基中的成分质量直接影响到细胞的生长和增殖能力。

优质的培养基会提供细胞所需的营养物质和生长因子。

4.2 培养条件的控制细胞的生长需要适宜的培养条件，如适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。

同时，细胞培养过程中需要定期更换培养基，以保持培养环境的稳定性。

4.3 质量检测与细胞鉴定在细胞培养的过程中，定期进行培养基的质量检测和细胞的鉴定非常重要。

常用的质量检测方法包括菌落计数法和PCR方法。

结果与讨论1. 细胞形态观察在细胞原代培养的过程中，我们进行了细胞形态的观察。