保护性氧化盐酸水解法分析蛋白质水解氨基酸.pdf

三字母符号时，氨基酸之间用连字符(－)或(· )隔开。
• 一级结构的全部内容包括： 多肽链数目、氨基酸组成、氨基酸顺序、连接方式、 二硫键的数目和位置、非氨基酸成分等
自1953年Sanger F.报道了牛胰岛素两条多肽链 的氨基酸序列以来，已有100，000多个不同蛋白质 的氨基酸序列被测定（简称蛋白质测序）。
蛋白质的一级结构研究
研究一级结构需要阐明的内容： • 1）蛋白质分子的多肽链数目。 • 2）每条肽链的末端残基种类。 • 3）每条肽链的氨基酸顺序。 • 4）链内或链间二硫键的配置等。
测定蛋白质的一级结构的主要意义： • 一级结构是研究高级结构的基础。 • 可以从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系。 • 可以为生物进化理论提供依据。 • 可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。
CH C
N
CH COO -
O
Peptide bond
* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸 缩合则形成三肽……
* 由二十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽 (oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的 肽称多肽(polypeptide)。
* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全， 被称为氨基酸残基(residue)。
R2 O
R3 O
H2N CH C HN CH C HN CH C
N端
氨基酸残基 氨基酸残基
肽链书写方式：N端→C端 肽链有链状、环状和分支状。
Rn O HN CH COH
C端
命名：根据氨基酸组成，由N端→C端命名
O
O
H3C CH C HN CH2 C HN CH COOH
NH2
CH2
CH H3C CH3
蛋白质的一级结构是指蛋 白质多肽链中氨基酸的排 列顺序，包括二硫键的位 置。其中最重要的是多肽 链的氨基酸顺序，它是蛋 白质生物功能的基础。

酸碱法水解缫丝废水中蛋白质工艺条件的研究作者：韦荣婷李军生黄国霞全玉娇来源：《湖北农业科学》2014年第05期摘要：以缫丝废水为试材，利用盐酸、氢氧化钠、磷酸水解丝胶蛋白质，优化缫丝废水中丝胶蛋白水解的最佳工艺条件，制备蚕茧氨基酸原料。

正交试验结果表明，3种水解方法中利用盐酸的水解效果最好，最佳工艺条件为溶液中盐酸浓度6 mol/L，水解温度130 ℃，水解时间8 h。

关键词：缫丝废水；水解；工艺条件；氨基酸中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1145-03在“东桑西移”工程的推动下，广西缫丝业迅速发展，缫丝废水也快速增加，缫丝企业带来的环境污染问题也日益凸显。

缫丝厂排放的废水中所含的溶解性污染物有丝胶蛋白质、蜡质、脂肪、无机盐等，以丝胶蛋白质为主，其化学需氧量（COD）的贡献率在70%以上。

丝胶蛋白质是一种宝贵的资源，有多种用途[1]。

目前，缫丝厂制丝生产过程中溶解下来的丝胶蛋白随生产废水的排放而流失，并成为缫丝生产废水中的主要污染物，会对水环境造成不良影响。

如果能够有效利用缫丝废水氮、磷、丝胶蛋白含量高的特点，应用于养鱼业，既可以达到净化污水的目的，又可以获得一定的经济利益，使缫丝企业与农业生产形成互利互惠的共生关系，从而提高资源的利用率，是废水资源化利用的一条良好途径，具有广阔的发展空间[2]。

丝胶蛋白分子量大，很难被鱼塘中的藻类和微生物消化吸收，丝胶蛋白进入机体内必须经过胃肠等消化器官分泌的消化液分解成游离的氨基酸才能被肌体吸收利用。

现代医学发现，小分子多肽蛋白进入人或动物肌体后，不经过消化，可直接被肠道吸收[3]。

丝胶蛋白多肽的制备方法有酸水解法、碱水解法及生物酶法。

本研究以缫丝废水为原料，利用盐酸水解、氢氧化钠水解、磷酸水解的方法，确定缫丝废水中丝胶蛋白水解的最佳工艺条件，制备蚕茧氨基酸原料，为后续研究新型缫丝废水作为鱼塘肥水剂提供参考。

有甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特异的生物学功能
所以，没有蛋白质就没有生命。
二、蛋白质的分类
（一）根据分子形状分：球状蛋白质、纤维状蛋白质。
（二）根据功能分：活性蛋白质、结构蛋白质。
（三）根据组成分：
� 简单蛋白质：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白。
� 结合蛋白质：色素蛋白、金属蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白、糖蛋白。
由 108 个氨基酸残基构成的前胰岛素原 pre-proinsulin），在合成的时候完全没有活性，当切去 N-端的 24 个氨基酸信号肽，形成 84 个氨基酸的胰岛素原（proinsulin），胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、 B 链之间的 33 个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。
c. 在镰刀状红细胞贫血患者中，由于基因突变导致血红蛋白β-链第六位氨基酸残基由谷氨酸改变为缬氨
� 参与机体的运动：如心跳、胃肠蠕动等，依靠与肌肉收缩有关的蛋白质来实现，如肌球蛋白、肌动蛋
白。
� 参与机体的防御：机体抵抗外来侵害的防御机能，靠抗体，抗体也称免疫球蛋白，是蛋白质。
� 接受传递信息：如口腔中的味觉蛋白、视网膜中的视觉蛋白。
� 调节或控制细胞的生长、分化、遗传信息的表达。
� 其它：如鸡蛋清蛋白、牛奶中的酪蛋白是营养和储存蛋白；胶原蛋白、纤维蛋白等属于结构蛋白。还
水键，如 Leu，Ile，Val，Phe，Ala 等的侧链基团。 3. 离子键（盐键）： � 离子键(salt bond)是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。 � 在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离
后带正电荷，二者之间可形成离子键。 4．范德华氏（van der Waals)引力：原子之间存在的相互作用力。 三、蛋白质的二级结构 � 蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链主链原子局部的空间结构，但不包括与其他肽段的相互关系及侧

各种氨基酸的生产工艺1、谷氨酸(1)等电离交工艺方法——从发酵液中提取谷氨酸，即将谷氨酸发酵液降温并用硫酸调PH值至谷氨酸等电点(pH3.0- 3.2)，温度降到10 以下沉淀，离心分离谷氨酸，再将上清液用硫酸调pH至1.5上732强酸性阳离子交换树脂，用氨水调上清液pH10进行洗脱，洗脱下来的高流分再用硫酸调pH1.0返回等电车间加入发酵液进行等电提取，离交车间的上柱后的上清液及洗柱水送去环保车间进行废水处理。

该工艺方法的缺点是：废水量大，治理成本高，酸碱用量大。

(2)连续等电工艺——将谷氨酸发酵液适当浓缩后控制40℃左右，连续加入有晶种的等电罐中，同时加入硫酸，控制等电罐中PH值维持在3.2左右，温度40℃进行结晶。

该工艺方法废的优点是：水量相对较少；缺点是：氨酸提取率及产品质量较差。

(3)发酵法生产谷氨酸的谷氨酸提取工艺——谷氨酸发酵液经灭菌后进入超滤膜进行超滤，澄清的谷氨酸发酵液在第一调酸罐中被调整pH值为3.20～3.25，然后进入常温的等电点连续蒸发降温结晶装置进行结晶，分离、洗涤，得到谷氨酸晶体和母液，将一部分母液进入脱盐装置，脱盐后的谷氨酸母液一部分与超滤后澄清的谷氨酸发酵液合并；另一部分在第二调酸罐中被调整pH值至4.5～7，蒸发、浓缩、再在第三调酸罐中调pH值至3.20～3.25后，进入低温的等电点连续蒸发降温结晶装置，使母液中的谷氨酸充分结晶出来，低温的等电点连续蒸发降温结晶装置排出的晶浆被分离、洗涤，得到谷氨酸晶体和二次母液。

(4)水解等电点法发酵液-----浓缩（78.9kPa，0.15MPa蒸汽）----盐酸水解（130 ℃，4h ）----过滤-----滤液脱色-----浓缩-----中和，调pH至3.0-3.2（NaOH或发酵液） -----低温放置，析晶-------谷氨酸晶体此工艺的优点：设备简单、废水量减少、生产成本低、酸碱用量省(5)低温等电点法发酵液-----边冷却边加硫酸调节pH4.0-4.5-----加晶种，育晶2h-----边冷却边加硫酸调至pH3.0-3.2------冷却降温------搅拌16h------4 ℃静置4h------离心分离--------谷氨酸晶体此工艺的优点：设备简单、废水量减少、生产成本低、酸碱用量省(6)直接常温等电点法发酵液-----加硫酸调节pH4.0-4.5-----育晶2-4h-----加硫酸调至pH3.5-3.8------育晶2h------加硫酸调至pH3.0-3.2------育晶2h------冷却降温------搅拌16-20h------沉淀2-4h-------谷氨酸晶体此工艺的优点：设备简单、操作容易、生产周期短、酸碱用量省。

五、氨基酸水溶肥、鱼蛋白水溶肥、海藻酸水溶肥、腐殖酸水溶肥、甲壳素水溶肥
作物吸收速度：氨基酸水溶肥＞鱼蛋白水溶肥＞海藻酸水溶肥 ＞腐殖酸水溶肥＞甲壳素水溶肥 对土壤改良作用：甲壳素水溶肥≥腐殖酸水溶肥＞鱼蛋白水溶肥 ＞海藻酸水溶肥＞氨基酸水溶肥 对根系作用：海藻酸水溶肥≥腐殖酸水溶肥＞甲壳素水溶肥＞氨 基酸水溶肥≥鱼蛋白水溶肥。 增加产量方面，因为不同时所需营养不同，以作物生长中后期使 用后产量来说：鱼蛋白水溶肥≥氨基酸水溶肥≥海藻酸水溶肥＞ 腐殖酸水溶肥＞甲壳素水溶肥
三、植物源&动物源氨基酸
不同来源的氨基酸因氨基酸的组成比例不同，对作物的效 果表现是有差异的。如需要提高作物的抗逆性，含脯氨酸、甘 氨酸较高的动物皮骨来源的氨基酸是最佳的选择，如要增加植 物的木质化、控梢、增加花青素，那含苯丙氨酸较高的动物血 液来源的氨基酸是较好的选择，如果是绿叶、促长，那含谷氨 酸较高的小麦、玉米等植物性氨基酸原料效果突出。所以说， 植物源氨基酸和动物源氨基酸没有好坏之分，只有针对其特性， 才能更好的发挥作用。
六、氨基酸水溶肥优劣鉴别
1、首先通过看其物理状态来辨别，好的水溶性肥料澄清无杂质， 几乎没有沉淀。
2、每种水溶肥的最低营养元素含量要求各不相同，可根据液体 肥料的标准含量要求，测一下其中所含营养元素的质量，值越大， 相同体积的水溶肥越重。
3、可以闻一下产品的气味，好产品没有明显气味或略有氨味， 酸碱度没掌握好水溶肥会有浓重的氨味，有刺鼻气味的一般是加 了不该加的物质造成。
七、水溶肥粉剂形状
腐 植 酸
海 藻 酸
海 藻 粉
鱼
甲 壳
蛋 白
素
是用虾、蟹、昆虫等甲壳动物外壳以及高等真菌类物质，采用现代物理化学技术，经过脱钙、脱蛋白之后的产物， 不溶于碱以及其他有机溶剂，也不溶于水。再通过进行脱乙酰基处理，就变成可溶于稀酸的可溶性甲壳素，再通 过生物技术分解，才能形成农业上的甲壳素（几丁质与壳聚糖）。

4.用HCL滴定
二、 自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红 外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消 化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
5.计算： 氨基酸态氮=〔 c×（V2-V1）×0.014×100 ） 〕/W×100 V1——用中性红为指示剂时，碱液所消耗 的体积 V2——用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液 消耗量
0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol。
（二）茚三酮的比色法
原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生 成蓝紫色化合物，可比色定量。（570nm）
一.双缩脲法 1.原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时 ，两分子缩和成双缩脲。 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络和 物，此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键（ —CO—NH—），与双缩 脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定 条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分 光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）
3．双指示剂：
① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。
② 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.4～10.6）
③ 0.1%中性红 50%乙醇溶液，（6.8～8.0） ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。
4．操作：
取相同两份样品20～30mg→分别于250ml三角瓶→各 加50ml蒸馏水 一份加中性红3滴→用0.1mol/L NaOH 滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚 酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→摇匀→用0.1mol/L NaOH 滴至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液ml数。

去保护基
R O CH3 (CH3)3C+ + CO2 + +NH3CHCNHCHCOO -
*1. 催化氢化和稀碱都不能除去BOC，通常用温 和的酸性水解法除去。
*2. 若氨基酸中有多个氨基，在接肽前均需保护。 *3. 用Z保护还是用BOC保护，视实际情况而定。
22.5.2 羧基的保护
RCHCOON+ H3
（甘-丙-亮）（Gly-Ala-Leu）
2 结构
1. 肽键和肽的几何形状
H O H RH O
NCCNC CNCC
HR H O H R
2. 二硫键
CH2SH
+
CHNH 3
COO-
空气氧化 Na +液NH3
CH2S
+
CHNH 3
COO-
SCH2
+
CHNH 3 COO-
Cys-Tyr-Ile-Glu-Arg-Cys-Pro-Leu-Gly •NH2
HCl
CH3OH
上保护基
R H2NCHCOOCH3
CH3
SO3H RCHCOOCH2
CH2OH NH2
上保护基
(CH3)2C=CH2
上保护基
O RCHCOBu-t
NH2
A
接肽
OR
R'CHCHNCHCOOCH3
NH2
去保护基 Na2CO3
A
接肽
Pd / H2
OR R'CHCHNCHCOOH
去保护基
NH2
蛋白质、碳水化合物、脂肪(甘油醇的 脂肪酸酯)是人的营养中的三种要素。
1 定义和分类
羧酸分子中烃基上的一个或几个氢原子被氨基取代生成的化合物叫氨基酸。

是一个很强的亲核基团，与烃化试剂如甲基碘容 易形成锍盐。
此反应可被巯基试剂逆转
6、半胱氨酸侧链上的巯基：
反应性能很高，在微碱性条件下，巯基发生解离形 成硫醇阴离子(-CH2-S-)，能与卤化烷例如碘乙酸，碘 乙酰胺，甲基碘等迅速反应，生成相应的稳定烷基衍 生物。
半胱氨酸的巯基能打开乙撑亚胺，即氨丙啶的环.
第3章：氨基酸
第一节：氨基酸的结构与分类
第二节：氨基酸的酸碱化学
第三节：氨基酸的化学性质
第四节：氨基酸的光学活性和光谱性质
第一节（一）：氨基酸的结构
一、氨基酸—— 组成蛋白质的基本单位
1、酸水解： 盐酸或硫酸回流煮沸20小时。 不引起消旋作用，得到L-氨基酸。色氨酸完全被破坏；羟基氨 基酸、天冬酰胺、谷胺酰胺部分被破坏。 2、碱水解：氢氧化钠共煮10—20小时。 产物是D型和L型氨基酸的混合物。产生消旋现象。多数氨基酸 遭到破坏。色氨酸稳定。 3、酶水解： 胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶水解。 不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。水解不彻底。
反应中1分子的半胱氨酸引起1分子的硫硝基苯甲酸的 释放。它在pH8．0时，在412nm波长处有强烈的光吸收， 因此可利用比色法定量测定-SH基。
二硫键的形成和打开 1、二硫键的形成
在痕量的金属离子如Cu2+，Fe2+，C02+和Mn2+ 存在下，巯基在空气中氧化显著提高。这些离子 可能是反应所需的催化剂。
3. 碱性氨基酸（+）
1、非极性R基(中性-非极性氨基酸)
共8种氨基酸,4种带脂肪烃侧链的氨基酸；2种含芳香环 氨基酸；1种含巯基氨基酸和1种甘氨酸。它们在水中的溶 解度比极性氨基酸小。
2、不带电荷的极性R基(中性-极性氨基酸)

2024年高考生物复习易错点解析—蛋白质和核酸的三个理解误区易错陷阱1：蛋白质变性和盐析本质相同。

【分析】高温使蛋白质变性的原因不是高温破坏了氨基酸之间的肽键，而是高温使肽链盘曲折登形成的空间结构发生不可逆变化。

低温和盐析未使蛋白质分子的空间结构发生不可逆变。

易错陷阱2：DNA分子和蛋白质分子在高温下空间结构都会出现不可逆的变化。

【分析】DNA分子和蛋白质分子对高温的耐受性不同，DNA分子对高温的耐受性通常比蛋白质分子高。

易错陷阱3：蛋白质的水解就是氧化分解。

【分析】蛋白质初步水解的产物是：多肽，彻底水解的产物是：氨基酸，氧化分解的产物是：二氧化碳、水和尿素。

【易错点提醒一】变性≠盐析【例1】某兴趣小组采用两种途径处理鸡蛋清溶液，过程如图所示。

有关叙述正确的是（）A．①③处理后溶液中含有氨基酸B．②过程可能破坏了蛋白质的空间结构C．高温后蛋白质容易被蛋白酶水解，吃熟鸡蛋容易消化D．④过程若加入取自动物消化道中的物质，会破坏蛋白质的空间结构但不影响肽键【答案】BC【解析】蛋白质经盐析处理后再溶解还是蛋白质，A错误；②过程可能破坏了蛋白质的空间结构，B正确；高温后蛋白质分子的空间结构变得伸展、松散，更易被蛋白酶水解，吃熟鸡蛋容易消化，C正确；④过程蛋白质被消化液中的蛋白酶催化水解，会破坏蛋白质的空间结构和肽键，D错误；【变式1-1】（2023·海南·高考真题）科学家将编码天然蜘蛛丝蛋白的基因导入家蚕，使其表达出一种特殊的复合纤维蛋白，该复合纤维蛋白的韧性优于天然蚕丝蛋白。

下列有关该复合纤维蛋白的叙述，正确的是（）A．该蛋白的基本组成单位与天然蜘蛛丝蛋白的不同B．该蛋白的肽链由氨基酸通过肽键连接而成C．该蛋白彻底水解的产物可与双缩脲试剂发生作用，产生紫色反应D．高温可改变该蛋白的化学组成，从而改变其韧性【答案】B【解析】该蛋白的基本组成单位是氨基酸，与天然蜘蛛丝蛋白的基本单位相同，A 错误；氨基酸是组成蛋白质的基本单位，该蛋白的肽链由氨基酸经过脱水缩合反应通过肽键连接而成，B正确；该蛋白彻底水解的产物为氨基酸，不能与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应，C错误；高温可改变该蛋白的空间结构，从而改变其韧性，但不会改变其化学组成，D错误。

• 日立L-8800氨基酸分析仪交换柱为 （4.6mm*60mm)填料为3μm磺酸型阳
• 离子树脂分离柱。
（二）离子交换树脂：
• 用作氨基酸分离柱的固定相一般都是固体的合 成离子交换剂。作为理想的离子交换剂应符合 下列要求：
• 1.机械强度好 • 2.不溶解且具有很好的化学稳定性 • 3.均匀球状颗粒 • 4.当装入柱子后应有良好的透通性 • 5.交换容量大 • 6.离子交换基应是单一的官能性的
酸性氨基酸：天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺。 碱性氨基酸：赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸。
2.按人体营养的需要又可分为必需氨基酸、半必 需氨基酸及非必需氨基酸（见下表）。
必需氨基酸 赖氨酸
色氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苏氨酸 蛋氨酸 缬氨酸
半必需氨基酸 组氨酸 精氨酸 甘氨酸 胱氨酸 酪氨酸
（（二二））氨氨基基酸酸的的分分类类：：
有两种分类： 1.按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：
中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨 酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、酪氨 酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱氨酸、半 胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚氨基酸类）。
• 二军大、天津总医院多家医学单位利用氨基酸分析技术 叙述了人体血高半胱氨酸含量的升高可导致动脉硬化及血 栓的形成。为医疗诊断病因提供了可靠的依据。
（二）饲料上的应用
• 1.质量控制：
• 各种饲料均由不同种类原料按一定比例配置而成，其中必 需氨基酸的含量和它们之间的比例必须恰当，才能满足畜 禽身体合成蛋白质的需要。测定原料和产品中的氨基酸含 量，以达到保证质量的目的。同时氨基酸分析技术即可对 产品质量进行简单又防止伪劣产品进入市场。

第1篇一、实验目的1. 了解盐类水解的概念和现象。

2. 掌握盐类水解的实验方法，学会利用pH试纸、pH计和酸碱指示剂检测溶液的酸碱性。

3. 理解盐类水解对溶液酸碱性的影响，并能根据实验结果分析盐类水解的规律。

二、实验原理盐类水解是指盐的离子与水分子反应，生成弱电解质的过程。

盐类水解的实质是盐中的离子与水分子反应，使水的电离平衡发生移动，产生氢离子或氢氧根离子，从而使溶液呈现酸性或碱性。

盐类水解的程度与盐中离子的性质有关。

一般来说，强碱弱酸盐的水解程度较大，溶液呈碱性；强酸弱碱盐的水解程度较大，溶液呈酸性；强酸强碱盐的水解程度较小，溶液呈中性。

三、实验仪器与试剂1. 仪器：烧杯、玻璃棒、pH试纸、pH计、酸碱指示剂、滴定管、电子天平、滤纸等。

2. 试剂：NaCl、NaOH、HCl、CH3COONa、NH4Cl、Na2CO3、KCl等。

四、实验步骤1. 配制溶液：分别配制NaCl、NaOH、HCl、CH3COONa、NH4Cl、Na2CO3、KCl等溶液。

2. 检测溶液酸碱性：利用pH试纸、pH计和酸碱指示剂检测上述溶液的酸碱性。

3. 观察并记录现象：观察溶液的颜色变化、沉淀生成等现象，并记录实验结果。

五、实验结果与分析1. NaCl溶液：呈中性，pH约为7。

2. NaOH溶液：呈碱性，pH约为13。

3. HCl溶液：呈酸性，pH约为1。

4. CH3COONa溶液：呈碱性，pH约为9。

5. NH4Cl溶液：呈酸性，pH约为5。

6. Na2CO3溶液：呈碱性，pH约为11。

7. KCl溶液：呈中性，pH约为7。

根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. 强碱弱酸盐的水解程度较大，溶液呈碱性；强酸弱碱盐的水解程度较大，溶液呈酸性；强酸强碱盐的水解程度较小，溶液呈中性。

2. 盐类水解对溶液酸碱性有显著影响，可根据溶液的酸碱性判断盐类水解的程度。

3. 盐类水解的规律为：有弱才水解，无弱不水解；越弱越水解，都弱双水解；谁强显谁性，同强显中性。

➢ 氨基酸可用于食品强化剂、调味剂、着色剂、甜味剂和增味剂。 如谷氨酸钠盐、赖氨酸。
➢ 氨基酸用于饲料添加剂，主要是甲硫氨酸、赖氨酸。 ➢ 氨基酸及其衍生物与皮肤成分相似，有调节皮肤pH值和保护皮
肤的功能，现已广泛用以配制各种化妆品。 ➢ 聚谷氨酸因性质上接近角蛋白，被开发作为人造革的涂料，使
人造革具备天然皮革的特点。
酪氨酸
色氨酸
氨基酸的分类
——根据氨基酸R基侧链的极性
R基团带正电荷的氨基酸
赖氨酸
精氨酸
组氨酸
氨基酸的分类
——根据氨基酸R基侧链的极性
R基团带负电荷的氨基酸
天冬氨酸
谷氨酸
氨基酸的分类
根据生物体的需要，可将氨基酸分为
必需氨基酸 半必需氨基酸 非必需氨基酸
Lys Val Ile Leu phe Met
氨基酸的分类
根据氨基酸R基侧链的极性，可将氨基酸分为 疏水性氨基酸（非极性氨基酸）
Ala Val Ile Leu Pro Met phe Trp
亲水性氨基酸（极性氨基酸）
不带电荷的极性氨基酸 带正电荷的碱性氨基酸 带负电荷的酸性氨基酸
Ser Thr Tyr Asn Gln Cys Gly
Lys Arg His
K2
2
氨基酸的酸碱性质
➢ 2个概念：氨基酸的等电点 pI 氨基酸的可解离基团的pK值
➢ 以谷氨酸为例：
pI= ½ (pK1+pKR) = ½ (2.19+4.25) = 3.22
氨基酸的酸碱性质
➢ 氨基酸的每一功能基团可被酸碱所滴定，可根据氨基酸的 滴定曲线来推算pK值。
氨基酸的酸碱性质
结论：
➢ 高于等电点的任何pH值，氨基酸带有净负电荷，在电场中 将向正极移动。

虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵 更精确、 敏、更精确、更快速以及自动化方向发展 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 基的，并且能在水解液中定量回收的水解 方法出现，很多因素如温度、时间、水解 方法出现，很多因素如温度、时间、 试剂、添加剂、 试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全 程度均有影响。 程度均有影响。 • 下面主要对一些常用的水解方法作简要介 绍。
引言
测定蛋白质的一级结构前的准备工作
样品纯度必须>97%以上； 纯度必须>97%以上 1. 样品纯度必须>97%以上； 聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带 测定蛋白质的相对分子质量 相对分子质量； 2. 测定蛋白质的相对分子质量； SDS-PAGE，凝胶过滤法， SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法 测定蛋白质多肽链种类和数目 多肽链种类和数目； 3. 测定蛋白质多肽链种类和数目； 种类： SDS种类： SDS-PAGE 数目： 末端氨基酸残基摩尔数/ 数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数 测定蛋白质的氨基酸组成 氨基酸组成； 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每 种氨基酸的个数； 种氨基酸的个数；
• 1、酸性水解
• 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中 是最 通用的水解剂。 通用的水解剂。 • 条件：6 mol/L HCI、真空、110℃，水解时间为 ～ 条件： 、真空、 ℃ 水解时间为20～ 24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 • 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋， 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 色氨酸则被完全破坏， 色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直中痕量杂质所破坏，丝氨酸 和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%。 和苏氨酸被部分水解，损失分别为 和 。

附件：氨基酸分析指导原则草案公示稿氨基酸分析指导原则氨基酸分析系指采用适宜的方法测定蛋白质、多肽或其他药物制剂中氨基酸组成和/或含量。

药品中氨基酸分析通常采用基于高效液相色谱法分离的衍生化法，涉及样品的水解、衍生化反应、分离检测和数据处理等操作。

本指导原则概述了药品中氨基酸分析的基本要求、蛋白质和多肽样品的水解、常用测定方法及其数据分析，为药品中氨基酸的分析提供指导。

1 基本要求1.1仪器氨基酸分析使用的仪器通常是高效液相色谱仪或氨基酸分析仪。

高效液相色谱仪适用于柱前衍生化产物的分离检测；对于柱后衍生化法，由于离子交换分离过程的复杂性和对柱后衍生化反应装置的特殊要求等，一般使用商品化的氨基酸分析仪。

1.2内标物氨基酸分析常采用内标法，内标物应是非天然存在的一级氨基酸，易于获取且价格便宜，在水解过程保持稳定，其色谱响应应与浓度成线性关系，具有独特的保留时间且与待测氨基酸能有效分离。

常用的内标物包括正亮氨酸、α-氨基丁酸、正缬氨酸、肌氨酸和硝基酪氨酸等。

内标物应在水解前或衍生化反应前添加到氨基酸混合物中，以消除由于水解、衍生化、取样、进样、溶液稳定性和色谱条件变化所导致的差异。

1. 3方法验证用于品种项下的氨基酸分析方法，包括样品水解，应参照分析方法验证指导原则（通则9101）进行方法学验证。

1.4水解管的清洗与要求为避免如手套粉末和指纹残留物等对分析结果的影响，水解管应清洗干净。

或使用一次性的水解管。

清洗方法：将水解管用1mol/L盐酸溶液中煮沸1小时，或将其浸泡在浓硝酸或浓盐酸-浓硝酸（1：1）混合液中1小时，再依次用高纯水、HPLC级甲醇冲洗，烘干并密封保存，以免再次污染。

2 蛋白质和多肽样品的水解蛋白质或多肽样品中的氨基酸是以结合形式存在，必须经过水解处理，形成游离氨基酸后才能进行氨基酸分析。

水解方法主要有酸水解，同时辅以碱水解。

酸水解中使用最广泛的是盐酸水解，所得氨基酸不消旋，但该方法引起一些氨基酸的破坏或部分破坏，如色氨酸被破坏，丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸被部分破坏，门冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺分别转化为门冬氨酸和谷氨酸。

5、形成西佛碱
• 氨基酸的a-氨基能与醛类反应生成弱碱，即西佛碱。西佛碱是转氨基 反应的中间物。
6、脱氨
• 氨基酸在氧化剂或酶作用下即脱氨产生酮酸。
7 成酯和成盐反应
• 成酯反应： – 在盐酸（干气）存在下，氨基酸与无水甲醇作用产生氨基 酸甲酯或乙酯。是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体。 • 成盐反应：氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸的碱金属 盐能溶于水,而重金属盐则不溶于水。 • 成酯、成盐后，羧基不参加反应，被掩盖，从而使氨基活性 突出，即活化了氨基，这就是氨基酸的酰基化和烃基化反应 在碱性溶液中进行的原因
2、与甲醛反应
• 氨基酸的甲醛滴定是测定氨基酸的一种常用方法。 • 甲醛滴定法： –当氨基酸溶液中存在lmol／L甲醛时，滴定终点由PH12 左右移至9附近，即酚酞指示剂的变色区域 • 测定蛋白质的水解程度： –氨基酸的氨基与甲醛反应生成羟甲基氨基酸和二羟甲基 氨基酸，使反应向放出质子的方向移动，酸性增加，PH 降低，可用氢氧化钠滴定。每放出一个质子，相当于一 个氨基酸
（1）氨基酸的解离曲线
• 以甘氨酸为例
（2）等电点（pI）
• 氨基酸处于正负电荷数相等即净电荷为零的兼性 离子状态时溶液的pH值。 • 等电点时氨基酸的性质 –溶解度最小，可分离不同氨基酸。 –pH=pI，氨基酸在电场中既不向正极也不向负极移动。 –pH>pI，氨基酸带净负电荷； –pH < pI ，氨基酸带净正电荷。
-氨基--甲硫基丁酸
2、不带电荷的极性R基氨基酸
• 这一组中有7种氨基酸。 – 比非极性R基氨基酸易溶于水。 • 甘氨酸 • 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸：羟基 • 天冬酰胺和谷氨酰胺：酰胺基 • 半胱氨酸：巯基（－SH）

同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋
白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。 （560nm）
方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测 定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷 等作物种子及肉类等样品测定。
紫外吸收法测定蛋白质含量
双指示剂： ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40% 甲醛中和至蓝色。
② 0.1%百里酚酞乙醇溶液，
③ 0.1%中性红50%乙醇溶液， ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 操作：同时取两份样， ① + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性
物质。
② + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH滴，中和了样液中氨基酸的羧 基与其它酸性物质的总和。二者之差可计算氨基酸含量。
Rf = a / b
溶剂前沿 b 样点 a
点样原点
优点：
① 展开时间短，一般在20—30分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。 ② 层析后得到的斑点小而清晰。 ③ 能够使用多种显色剂。 ④ 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10—100倍） 精确 到0.01ug。 ⑤ 也可用于大量分离＞500 mg，作为样品制备层析。
存于溶液中，过滤后，用凯氏定氮法分别测定沉淀和滤液中 的氮含量。
蛋白质氮和非蛋白质氮的测定
（2）用Cu(OH)2作沉淀剂： 原理：样品经粉碎后加水磨至均匀后，转入离心管中，以 Cu(OH)2沉淀蛋白质，离心分离，并用蒸馏水洗涤。用凯氏 定氮法分别测定溶液中的非蛋白氮和沉淀中的蛋白质氮。
氨基酸的一般定量测定 1、甲醛滴定法 原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有 酸性 —COOH 基，成中性内盐，加入甲醛 溶 液后，与 —NH2— 结合，碱性消失，再用强碱来滴定 — COOH 基。 特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中 氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）

非必需氨基酸 谷氨酸
天门冬氨酸 丙氨酸 丝氨酸 脯氨酸 羟脯氨酸
• 动物的必需氨基酸除上述8种外，还有精 氨酸、组氨酸共10种。
（三）氨基酸的化学性质
• 氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此 它们都能产生氨基与羧基的一般反应， 如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱的中 和作用等。有些氨基酸由于存在其它基 团而产生特殊反应，如半胱氨酸的巯基 （－SH)
碱性氨基酸 > 芳香族氨基酸 > 中性氨基酸 > 酸性氨基酸及羟基氨基 酸
4.提高流动相PH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离子交换柱 上洗脱下来。洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基 酸。
5.氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺序有一定; 标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定;由此可计算出样品中
• DYDA在570nm处有最大吸收。 • 脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物
质，在440nm处吸收峰最大。 • 生除成氨有基色酸物以质外（，这如N种H反2肽应类机也理可现与应茚用三于酮我反们应使
用的氨基酸分析仪之中）。
三、氨基酸分析仪基本分析原理
• 氨基酸的分离分析方法很多，近几年来 一般认为离子交换色谱法是比较准确的 定量方法。氨基酸分析仪就是以此为基 础研制出来的。近几年越来越多的日立 L-8800型氨基酸分析仪被引进到各行各 业之中，为我们科学研究及检测提供了 现代化的手段。
OPA是快速反应剂，有些氨基酸反应极其不稳定，特别 是甘氨酸、赖氨酸衍生物的信号衰减很快，一天变化很 大。从以往我们做的实验来看此方法的变异系数CV%一 般为5％左右，个别的氨基酸如组氨酸可达9%左右，尤 其对带有盐分的饲料氨基酸类样品特别不适合，因样品 中带有的盐分直接影响衍生（紫外法基线不好）。