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第五课蛋白质和多肽的氨基酸序列测定

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蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析

蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析

第十章蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位,也是生物体维持生长所必需的营养物质，它们参与机体的代谢过程，具有广泛的生物活性和特殊的生理功能。

在对肽和蛋白质的结构和功能进行研究时，往往需要将其进行完全水解，测定其氨基酸的组成；生物体内游离氨基酸在神经信息传递、代谢的调节以及肽、蛋白质的合成等生理过程中起着重要作用，为了了解其生理功能及某些外源性刺激对其功能的影响，也需要对生物体液、细胞或组织内的游离氨基酸进行分析。

除了氨基酸总量测定外，往往更需要对个别氨基酸进行分析。

常用的氨基酸分析方法可归纳为两类：衍生化间接分析法和无需衍生化的直接分析法。

蛋白质的一级结构即蛋白质中多肽链中氨基酸的排列顺序，既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有助于蛋白质的基因结构的研究。

在某些特定情况下，基因突变常常导致蛋白质中氨基酸的序列发生改变，从而引起功能失调和疾病产生。

因此，测定蛋白质的氨基酸序列对新的诊断学方法开发、新的治疗方法建立以及多肽类药物的研究均有重要的意义。

§10. 1 氨基酸的衍生化间接分析法无论是游离氨基酸还是水解氨基酸的测定，由于多数氨基酸都缺少结构检测特征，既无紫外吸收，又无荧光，必须使之衍生，转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质才能检测分析。

§10. 1. 1 氨基酸的衍生化反应为了使测定氨基酸的方法灵敏度高，分辨率好，氨基酸的衍生化是关键步骤之一。

近年来人们致力于开发灵敏度高、衍生操作简单、形成的氨基酸衍生物稳定的衍生化试剂。

常见的衍生化试剂有茚三酮、邻苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、异硫氢苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）等。

茚三酮在酸性（pH = 3 ~ 4）和加热条件下与氨基酸反应生成氨、二氧化碳和蓝－紫色的复合物（最大吸收波长为570 nm）：(10.1)除了-氨基酸外，其它的氨基酸也可生成有色物质，但无二氧化碳生成，-，-，-和-氨基酸比-氨基酸反应慢得多，生成的是蓝色物质，而亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应形成黄色化合物（最大吸收波长为440 nm ）。

蛋白质分析鉴定精品课件

蛋白质分析鉴定精品课件
对于由两条及两条以上多肽链组成 的蛋白质分子，则需将其拆开（断 裂二硫键）并单独分离出来。
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2. 分析多肽链的氨基酸组成。
将多肽链用酸或酶完全水解，再用离子交换树脂 （或用高效液相色谱）将各种氨基酸分离开，测 定其含量并计算各种氨基酸组成的百分比。下图 表示蛋白质的水解产物通过Moor-Stein Dowex 50 离子交换柱层析的自动分析结果。
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双向电泳：
2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究 中分离复杂蛋白质混合物的首选技 术。
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双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 （包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可 重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修 饰（如酶性或化学性降解等）。
a 加入脱水剂除去水膜 b 使pH=pI c 加入电解质使质点表面失去同种电荷。
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五、蛋白质的变性作用
天然蛋白质受到理化因素的影响， 氢键、盐键等次级键维系的高级结构遭 到破坏，分子内部结构发生改变，致使 生物学 性质、理化性质改变的现象。
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物理因素： 加热、紫外线、X—射线、超声波
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双向电泳的分类
非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下 进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观 分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是 一样的
非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性 IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也 在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价 键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。

实验五蛋白质序列分析

实验五蛋白质序列分析

<40 stable >40 unstable
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（二）蛋白质疏水性分析
• 疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力 • 分析蛋白质氨基酸亲疏水性是了解蛋白质折叠的
第一步 • 氨基酸疏水分析为蛋白质二级结构预测提供佐证 • 是分析蛋白质跨膜区重要一步
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蛋白质亲疏水性分析
• ProtScale工具 /tools/protscale.html
直接填写swissprottremblac号accessionnumber直接在搜索框中粘贴氨基酸序列输入swissprottremblac号打开proteintxt将蛋白质序列粘贴在搜索框中输入swissprottremblac号分不同的功能域肽段以p02699为例输出结果功能域用户自定义区段点击不同功能域得到以下结果氨基酸数目相对分子质量理论pi氨基酸组成正负电荷残基数消光系数半衰期原子组成分子式总原子数不稳定系数脂肪系数总平均亲水性40stable40unstable10二蛋白质疏水性分析分析蛋白质氨基酸亲疏水性是了解蛋白质折叠的第一步是分析蛋白质跨膜区重要一步11protscale工具http
②将目的序列粘贴到序列输入框中，选择BLOSUM62 记分矩阵运行BlastP程序。NCBI的BlastP程序要求输 入格式为FASTA格式；
③如果BlastP检测到了高度同源的序列，将有可能提 示目的序列的生物学功能
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基于序列同源的蛋白质功能预测
序列相似性比较作为一个非常有效的工具用于同源 基因的发现
• 典型的有亮氨酸拉链，存在7残基 重复结构（heptad repeat)，以a，
b， c，d，e，f，g位置表示，其中a 和d位置为疏水性氨基酸，而其他位 置 残 基为亲水性

蛋白质组学与分析技术课复习思1考

蛋白质组学与分析技术课复习思1考

蛋白质组学与分析技术课复习思考一、名词解释1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。

2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。

二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。

3、三步纯化策略：第一步:粗提。

纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第二步：中度纯化。

去除大部分杂质最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第三步：精细纯化。

达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析4、高效纯化策略在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。

5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。

如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。

固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。

阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。

其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。

氨基酸测序

氨基酸测序

百泰派克生物科技
氨基酸测序
蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的生物大分子，氨基酸的排列顺序以及种类在很大程度上决定了蛋白的空间结构和生物学功能。

因此，氨基酸序列分析在揭示蛋白质结构和功能方面发挥着重要的作用，也为人工合成活性多肽提供了依据。

氨基酸序列测定方法主要包括非质谱法和质谱法。

非质谱法中最出名也最常用的就是传统的Edman降解法，主要用于蛋白质的N末端测序，但它不能对N末端封闭或修饰的序列进行测定。

基于质谱的测序方法可以用于蛋白质的末端（N/C端）测序、蛋白全序列测定、从头测序和突变分析。

质谱测序法通过分析测量离子的质荷比质谱图来确定氨基酸的分子质量，再结合相应的数据库推断氨基酸的种类。

质谱法简便快速、灵敏性高，也可以对N末端封闭或修饰的序列进行分析，在一定程度上克服了Edman测序法的缺点。

百泰派克生物科技可基于Edman降解法以及Thermo公司的Obitrap Fusion Lumos
质谱仪提供氨基酸序列分析一站式服务，欢迎免费咨询。

蛋白质和多肽的氨基酸序列分析

蛋白质和多肽的氨基酸序列分析
蛋白质和多肽的氨基酸序 列分析
• 引言 • 蛋白质和多肽的氨基酸组成 • 氨基酸序列分析方法 • 氨基酸序列分析的应用 • 氨基酸序列分析的挑战与展望
01
引言
蛋白质和多肽的定义
蛋白质
由氨基酸组成的大分子，是生命 活动中不可或缺的组成部分，具 有多种生物学功能。
多肽
由2-50个氨基酸组成的短链肽， 具有较低的分子量和稳定性，在 生物体内发挥着重要的生理作用 。
蛋白质相互作用研究
通过分析蛋白质之间的相互作用，可以了解蛋白质在细胞内的功能 和调控机制，为疾病治疗提供新思路。
蛋白质修饰研究
通过对蛋白质的修饰进行分析，可以了解蛋白质的修饰对蛋白质功 能的影响，为药物设计和治疗提供依据。
生物进化研究
物种进化关系研究
通过对不同物种的氨基酸序列进行分析，可以了解物种之间的进 化关系和亲缘关系。
02
蛋白质和多肽的氨基酸组成
常见氨基酸的种类和特性
甘氨酸（Gly）：最简单的氨基酸，无手性碳原 子，呈中性。
01
缬氨酸（Val）：支链氨基酸，呈中性。
03
02
丙氨酸（Ala）：含有三个碳原子的氨基酸， 呈中性。
04
亮氨酸（Leu）：支链氨基酸，呈中性。
异亮氨酸（Ile）：支链氨基酸，呈中性。
05
药物设计与优化
氨基酸序列分析在药物设计 与优化中发挥着关键作用。 通过对靶点蛋白或活性多肽 的氨基酸序列进行分析，可 以发现潜在的药物作用靶点 ，为新药研发提供有力支持 。
生物进化与物种 分类
氨基酸序列分析在生物进化 与物种分类中具有重要价值 。通过对不同物种的蛋白质 和多肽进行氨基酸序列比对 ，可以揭示物种之间的亲缘 关系和进化历程。

edman 化学降解法

edman 化学降解法【原创实用版】目录一、什么是 Edman 化学降解法二、Edman 化学降解法的原理三、Edman 化学降解法的应用范围和优势四、Edman 化学降解法的局限性五、结论正文一、什么是 Edman 化学降解法Edman 化学降解法是一种用于测定多肽和蛋白质氨基酸序列的方法。

这种方法主要通过多肽或蛋白质与 PTH（苯甲酸）试剂的反应，对其进行降解并分析，从而得到其氨基酸序列。

Edman 化学降解法具有操作简便、效率高、用量少等优点，被广泛应用于蛋白质和多肽的研究领域。

二、Edman 化学降解法的原理Edman 化学降解法的原理主要是利用 PTH 试剂与多肽或蛋白质中的氨基酸残基发生反应，形成苯甲酰化氨基酸。

在反应过程中，PTH 试剂会与氨基酸残基上的羧基形成一个稳定的苯甲酰胺结构，从而将氨基酸残基从多肽或蛋白质中切割下来。

通过连续的降解反应，可以逐步获取多肽或蛋白质中的氨基酸残基序列。

三、Edman 化学降解法的应用范围和优势Edman 化学降解法主要应用于多肽和蛋白质氨基酸序列的测定。

在实际操作中，该方法可以可靠地测定肽链的 30 个左右氨基酸残基序列，最多可以分析 50-60 个氨基酸残基。

在最好的条件下，每形成一次 PTH-氨基酸，效率可保持在 99% 以上。

而且此法用量少，一般只用 10-100 皮摩尔的多肽即可测定氨基酸序列。

对于肽链较长的多肽，可以先将肽链切断成多个小肽，对这些小肽进行氨基酸分析，然后将这些信息拼接起来，得到起始肽链中的氨基酸序列。

四、Edman 化学降解法的局限性尽管 Edman 化学降解法在多肽和蛋白质氨基酸序列测定方面具有较高的效率和可靠性，但它也存在一定的局限性。

首先，该方法需要使用一定量的化学试剂，虽然在实验过程中用量较少，但在大规模应用时，仍需要考虑成本问题。

其次，对于某些结构特殊或稳定性较差的多肽和蛋白质，Edman 化学降解法可能会出现降解不完全或降解产物不纯的问题，影响测定结果的准确性。

蛋白质分子基础5-蛋白质一级结构测定


C末端分析

a)肼解法 b)还原法：硼氢化锂还原剂 c)羧肽酶法

还原法
肽链C末端AA ↓硼氢化锂 α－氨基醇 ↓水解 C末端氨基酸+ α－氨基醇 ↓ 色谱法鉴定
羧肽酶法

羧肽酶法：
最有效，最常用的测C端殘基方法 性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降 解，释放出游离AA。
巯基含量测定
DTNB法(5.5’-二硫代双(-2-硝基苯甲酸)
Protein-Ｓ- +R-S-S-R(DTNB) Protein-S-S-R+RSProtein-SH Protein-S-S-Protein+RS-(CNT) R
-
-COOH -NO2
反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收， 根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含 量。

优点:Trp在水解中不受破坏。
蛋白质的水解
磺酸水解




4mol/L 甲基氨酸 ( 含 0.2%β- 吲哚乙胺 ) 色氨酸可 回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸 钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破 坏。 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。
蛋白质化学
蛋白质一级结构的测定
序列测定的基本方法学

将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的 肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。 再将不同方法得到的序列进行比对，就可以 得到肽链的一级结构。
序列测定一般步骤

纯度要求:纯度在97%以上。
双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。

生化组习题(配答案) (1)

生化测试一 氨基酸一、填空题1.氨基酸的结构通式为 。

2.氨基酸在等电点时，主要以 兼性/两性 离子形式存在，在pH>pI 的溶液中，大部分以 阴离子形式存在，在pH<pI 的溶液中，大部分以 阳 离子形式存在。

3.生理条件下（pH7.0左右），蛋白质分子中的 Arg 侧链和 Lys 侧链几乎完全带正电荷，但His 侧链带部分正电荷。

4.测定蛋白质紫外吸收的波长，一般在 280nm ，主要由于蛋白质中存在着 Phe 、Trp 、Tyr 氨基酸残基侧链基团。

5.皮肤遇茚三酮试剂变成 蓝紫 色，是因为皮肤中含有 蛋白质（氨基酸）所致。

6.Lys 的pk 1（α—COOH ）=2.18，pk 2（α—3H N +）=8.95，pk 3（ε—3H N +）=10.53，其pI 为 9.74。

在pH=5.0的溶液中电泳，Lys 向 负 极移动。

7.Henderson —Hasselbalch 方程为pH=pKa+lg[质子受体]/ [质子受体]。

8.实验室常用的甲醛滴定是利用氨基酸的氨基与中性甲醛反应，然后用碱（NaOH ）来滴定 上放出的 NH 3+/氨基。

9.一个带负电荷的氨基酸可牢固地结合到阴离子交换树脂上，因此需要一种比原来缓冲液pH 值 小 和离子强度 高 的缓冲液，才能将此氨基酸洗脱下来。

10.用 N-溴代琥珀酰亚胺 试剂可区分丙氨酸和色氨酸。

二、选择题1.区分极性氨基酸和非极性氨基酸是根据 （C ）A. 所含的羧基和氨基的极性B. 所含氨基和羧基的数目C. 所含的R 基团为极性或非极性D. 脂肪族氨基酸为极性氨基2.下列哪一种氨基酸不属于人体必需氨基酸 （D ）A. 亮氨酸B. 异亮氨酸C. 苯丙氨酸D. 酪氨酸3.下列哪一组氨基酸为酸性氨基酸： （D ）A. 精氨酸，赖氨酸B. 谷氨酸，谷氨酰胺C. 组氨酸，精氨酸D. 谷氨酸，天冬氨酸4.含硫的必需氨基酸是 （B ）A. 半胱氨酸B. 蛋氨酸C. 苏氨酸D. 亮氨酸5.芳香族必需氨基酸包括 （D ）A. 蛋氨酸B. 酪氨酸C. 亮氨酸D. 苯丙氨酸6.含四个氮原子的氨基酸是 （B ）A. 赖氨酸B. 精氨酸C. 酪氨酸D. 色氨酸7.蛋白质中不存在的氨基酸是下列中的哪一种？（D ）A. 赖氨酸B. 羟赖氨酸C. 酪氨酸D.鸟氨酸8.在蛋白质中不是L-氨基酸的是（B ）A. 苏氨酸B. 甘氨酸C. 半胱氨酸D. 谷氨酰胺9.谷氨酸的PK 值为2.19, 4.25, 9.76; 赖氨酸的PK 值为2.18, 8.95, 10.53; 则它们的PI 值分别为（B ）A. 2.19和10.53B. 3.22和9.74C. 6.96和5.56D. 5.93和6.3610.从赖氨酸中分离出谷氨酸的可能性最小的方法是（D ）A. 纸层析B. 阳离子交换层析C. 电泳D. 葡萄糖凝胶过滤11.用于确定多肽中N-末端氨基酸的是（C ）A. Sanger 试剂B. Edman 试剂C. 两者均可D. 两者均不可12.有一蛋白质水解物,在PH6时,用阳离子交换柱层析,第一个被洗脱的氨基酸是（C ）A. Val (PI5.96)B. Lys (PI9.74)C. Asp (PI2.77)D. Arg (PI10.76)13.下列那种氨基酸属于非编码氨基酸？（D）A. 脯氨酸B. 精氨酸C. 酪氨酸D. 羟赖氨酸14.可使二硫键氧化断裂的试剂是（C）A. 尿素B. 巯基乙醇C. 过甲酸D. SDS15.没有旋光性的氨基酸是（C）A. AlaB. ProC. GlyD. Glu16. Sanger试剂是（B）A.苯异硫氰酸酯B. 2,4—二硝基氟苯C. 丹磺酰氯D.β-巯基乙醇17.酶分子可逆共价修饰进行的磷酸化作用主要发生在哪一个氨基酸上（B）A. AlaB. SerC. GluD. Lys18.当含有Ala,Asp,Leu,Arg的混合物在pH3.9条件下进行电泳时，哪一种氨基酸移向正极(+)（B）A. AlaB. AspC. LeuD. Arg19.下列哪种氨基酸溶液不使平面偏振光发生偏转（B）A. ProB. GlyC. LeuD. Lys20.对哺乳动物来说，下列哪种氨基酸是非必需氨基酸（C）A. PheB. LysC. TyrD. Met21.一个谷氨酸溶液，用5ml的1M的NaOH来滴定，溶液中的PH从1.0上升到7.0，下列数据中哪一个接近于该溶液中所含谷氨酸的毫摩尔数为（B）A. 1.5B. 3.0C. 6.0D. 1222.下列AA中含氮量最高的是（A）A. ArgB.HisC.GlnD. Lys23.下列在280nm具有最大光吸收的基团是（A）A.色氨酸的吲哚环B.酪氨酸的酚环C.苯丙氨酸的苯环D.半胱氨酸的硫原子24.在生理pH值条件下，具有缓冲作用的氨基酸残基是（C）A. TyrB. TrpC. HisD. Lys25.下列关于离子交换树脂的叙述哪一个是不正确的？（D）A.是人工合成的不溶于水的高分子聚合物B.阴离子交换树脂可交换的离子是阴离子C.有阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两类D.阳离子交换树脂可交换的离子是阴离子26.下列哪种氨基酸可使肽链之间形成共价交联结构（D）A.MetB. SerC. GluD. Cys27.下列氨基酸中哪个含有吲哚环？（C）A.MetB. TyrC. TrpD. His三、名词解释1. α-氨基酸：是含有氨基的羧酸，氨基连接在α-碳上。

蛋白质测序PPT课件


+
NH CH C NH CH C
H2O
CH2 CH2 O NH CH C O
Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下， 能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成黄色 二硝基苯衍生物（DNP-氨基酸）。
弱碱
（黄色）
② Edman 降解法(I)
PITC
（pH8.3）
CH3NO2 三氟乙酸
Edman 降解法(II)
② Edman 降解法(I)
PITC法可用来连续测定出60个以上的氨 基酸顺序。
多肽链的选择性降解
化学法：溴化氰(CNBr)水解法，它能
选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成 的肽键。
CH3 S：
CH2
CH2 O
RO
Br-
NH CH C NH CH C + Br C+ N
CH3 S+ C N
CH2
CH2 O
RO
NH CH C NH CH C
CH2
CH3 S C N CH2 O
RO
多肽链的选择性降解
酶解法:
胰蛋白酶：得到以Arg和Lys为C-末端的肽段，
产生的肽段数一般等于Arg和Lys总数加1
多肽链的选择性降解 酶解法:糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）
专一性水解芳香族氨基酸羧基端形成的肽 键，若羧基端与Pro相连，则不被水解
多肽链的选择性降解 酶解法:酸性磷酸酶
多肽链的选择性降解 酶解法: 弹性蛋白酶
链 的
的氨
分 子
基 酸
比组
成
，
(五)分析多肽链的N-末端和C-末端。
(五)分析多肽链的N-末端和C-末端
在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的 是N-端氨基酸分析法。
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在这两种序列仪中，Edman降解后的PTH—氨基酸衍生物可及时直接
从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行PTH—氨基酸衍生物的定性及 定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一 用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图 4.2为标准PTH—氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在20min内将各组分 较好分离，需选择合适的色谱条件，表4.1列出了各种条件的改变导致个 别组分位置的迁移及图谱的改善。
四、影响C端测序反应产率的因素 C端测序副反应较多，最高初始产率仅为20％，而对于Glu，Asp， Ser，Thr等氨基酸，其产率将更低。如C端富含上述几种氨基酸，测序 将十分困难。另外，一旦遇到Pro，由于吡咯环的存在而不能与乙酸酐 反应成环，整个测序过程将终止。 到目前为止，C端测序可测1～10个残基，一次测序需要的量比N端测 序要大得多，至少需1nmol。 此外，因为不同的氨基酸反应产率不同，所以，对图谱的分析也比N 端测序复杂，需要较多的经验。目前C端测序结果最好的一个样品是马 肌红蛋白原，可测C端10个以上残基，通常将其作为标准样品来判断仪 器的稳定性。 另外，由于副反应的存在，有的氨基酸将生成不止一种ATH衍生物。 如Arg的ATH衍生物可能被乙酰化或烷化；Tyr-ATH可被乙酰化；Cys 被修饰后将形成丙烯酰胺化的Cys-ATH以及脱氢Ala-ATH；脱水ThrATH将产生两个非对映异构体。
第五课蛋白质和多肽的氨基 酸序列测定
蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长 链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、 卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的 一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸 序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级 结构的信息也有助于对其基因结构的研究。 目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即： ①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来； ②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。 其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有 裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍 采用，可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。 第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色 谱进行分离分析。 本章将就蛋白质和多肽的N端、C端氨基酸序列分析 的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品基形成混合酸酐后，与硫氰哌啶进一步作用形成酰 胺，以保护侧链。
(3)烷基化 由于C端环化形成的TH衍生物较为稳定而不易被切割，因 此产率不高。用溴甲基萘选择性地烷基化修饰硫原子，形成 Alkylated-TH(ATH)衍生物，裂解产率将大大提高。
(4)修饰Thr和Ser的羟基 蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。在活 化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完 全，在N—甲基咪唑(NMl)和乙酸酐的共同作用下，Thr和 Ser上的羟基基本被乙酰化。
(5)裂解和衍生 C端的ATH衍生物在酸性条件下与[NCS]—反应而被 裂解生成ATH—氨基酸，新的C端自动形成TH，而不必重新 活化。 因此，整个测序过程只需在开始时对C端进行一次性活 化，并修饰Asp和Glu侧链羧基以及The和Ser的羟基。实 际上，循环反应的只有烷基化和裂解两步，其全过程图解如 下图。
三、气相序列仪 自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为1～2mg。1978年Tarr 等将一种四级铵盐聚合物“polybrene”引入了蛋白质、多肽的序列测 定，它能和肽链中的极性基团作用(非共价键合)而将蛋白质和多肽有效 地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子 生物学对蛋白质微量分析的要求，20世纪80年代初，Hewick及 Hunkpillar等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型 玻璃反应室(内部体积约0.05m1)代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用 polybrene固定样品，Edamn降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式 输送，其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列 仪具有以下明显优点： ①灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需50～100pmol； ②试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的l／10，降低了费用； ③缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。 20世纪80年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸 以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同 样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性PVDF膜的问世， 蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行 固相序列分析。
一、C端分析原理 基于与N端Edman降解类似的原理，C端分析采用化学试 剂与蛋白质和多肽的α—羧基反应，反应后的C端衍生物被 切割下来，通过HPLC系统进行分离分析。 一个完整的C端序列分析包括以下几个步骤： (1)活化 蛋白质和多肽C端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并进一步 环化成嗯唑酮，而侧链上的羧基形成的混合酸酐难以成环。C端的嗯唑 酮在硫氰四丁铵的作用下，转化为乙内酰硫脲(thiohydantoin，TH)。
第一节 N端分析原理
一、耦 联 蛋白质和多肽的自由α—氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试 剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容 易断裂。
二、裂 解 在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的 第二个氨基酸残基暴露出自由的α—氨基，又可与PITC进行 耦联反应。
三、转 化 ATZ—氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25％)中可转化 成稳定的PTH—氨基酸。
四、PTH—氨基酸的鉴定 可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及 质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色 谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确 等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广 泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。通常选用C—18反 相柱进行分离。
第二节 N端蛋白质序列仪
第六节 C端序列分析
虽然建立在Edman化学法上的自动化N端测序技术日趋成熟，但仍 有不少问题需借助C端序列分析来解决。C端测序尤其适合于基因重组蛋 白是否正确表达的鉴定和大规模生产时的质量控制、N端封闭蛋白的分 析以及DNA探针的设计。 由于选择性对C端羧基进行耦联修饰并从C端逐一将氨基酸残基切下 较N端测序困难，在过去的近20年里，虽然为数不少的蛋白质化学家致 力于C端测序研究，但目前仍不能和N端测序技术程度媲美。蛋白质化学 工作者曾利用羧肽酶分析C端氨基酸残基，但是由于不同的羧肽酶对个 别氨基酸残基有选择性，使用时仍有一定困难。 最近，由于对化学法测定C端技术进行了一系列改进，已有了自动化C 端序列仪问世。所以介绍一种自动化C端测序方法的原理及应用。
五、结语和展望 目前，C端序列测序技术已初步成熟，并开始发挥作用。但其反应的 效率与N端Edman降解测序法有一定的差距。 因此，目前的主要问题是如何提高反应的产率，特别是如何改善T， S，D，E几种氨基酸的测定，以及如何解决P终止测序的问题。如果在 上述几方面取得进展，将使C端可测残基数大大增加，并减少样品所需 量。另外，近年来发现，很多活性多肽的C端是酰胺化的，如果能检测 酰胺化的C端残基，将对活性多肽的研究有很大的帮助。 C端测序技术仍处于研究和发展阶段，虽然该技术还不尽完善，但对 于确认表达蛋白的C端是否正确，以及判断在表达、纯化过程中是否发 生了不必要的加工大有帮助。
二、C端蛋白质序列仪 近年来，已有商品化的C端序列仪问世。C端序列仪一般 由N端序列仪改装而成，其基本结构与后者相似，两者的不 同之处主要在于： ①反应所用的试剂不同，因此两者不可兼容，否则极易堵 塞管道； ②在C端序列仪中，所有的化学反应均在弹筒型反应室中 进行，切割下来的ATH—AA仅在转化腔内干燥和溶解后即 进入HPLC系统分离分析；而在N端测序仪中，ATZ— AA需 在转化腔中转化为PTH-AA。
第三节 影响N端Edman反应裂解率的因素
在测序中往往可以发现，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单 个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是 由于Edman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可 能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为95％～98 ％。因此，经过50次循环后，PTH—氨基酸分析谱中将出现较多杂峰， 影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至N端第50个氨基 酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。 ①对于有些蛋白质由于含有较多的对Edman反应敏感的残基或肽键，裂 解效率将更低。 ②循环至Ser和Thr时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基 分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与Ser和Thr上的羟 基反应，继而部分封闭Ser和Thr的N端—氨基。 ③另外，丝氨酸和苏氨酸的PTI-{{汀生物也会部分转化成其他产物，造 成产率的降低。 耦联试剂PITC本身也将发生下列副反应，形成一些“杂质”。测序完 成 后，电脑将每个循环的产率处理，得出起始产率(initial yield)和重复产 率 (repetitive yield)，其中通过起始产率可以估计蛋白质的真实含量， 有时可以推测N端是否封闭(和氨基酸组成分析测得的含量相差甚远)，而 重复产率则表明机器是否正常运转。另外，如果蛋白质或多肽中含有 过多的Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸残基，也将降低这两个数值。