大连理工大学大学生创新性实验计划项目
申报书
项目负责人:
所在院系：化工学院化学工程系
指导教师:
申请时间：2009 年6月29日
教务处制表
项目名称人源脐血造血干/祖细胞的体外扩增
申请经费10000元起止时间
姓名院（系）专业班级学号联系电话
化工学院化工英强化工学院化工英强
(同类研究工作国内外研究现状与存在的问题等)
数量稀少的造血干 / 祖细胞(Hematopoietic stem/progenitor cells,
HSPC)是体内各种成熟血细胞的唯一来源，它主要存在于脐带血、骨髓和外 周血中。
HSPCs 在治疗贫血等血液疾病、白血病等癌症病人高剂量放化疗后的 造血重建、基因治疗
和免疫治疗以及制备成熟血液产品等方面有极重要的临 床应用价值，因此多年来一直得到科
研工作者和临床医生的高度重视和关注。
脐带血是目前临床上HSPC 的重要来源，其富含更早期的 HSPCs 免疫原 性弱、对
异源性抗原产生的抗体少、成熟性 T 细胞较少、采集和保存容易、无 肿瘤细胞污染、对供者
无损伤及副作用、 CD34 CD3$与CD34 CD33?的比例较
高等一系列优点，使得与脐带血有关的造血干 /祖细胞的研究成为热点。
然而，脐带血中HSPC 的数量有限，无法满足临床移植的需要。近年来不 断发展的造
血细胞体外扩增技术，希望能通过在短时间内扩增细胞，来满足 这一需求。但研究发现，添加大量细胞因子所扩增的 HSPC 常发生过度分化， 输入体内后的移植效果不能令人满意。因此，寻找更加合理的体外扩增手段， 使造血细胞在体外大量扩增的同时，又能保持其干 /祖细胞的特性，是研究中 要解决的关键问题。
自干细胞的增殖发育存在于微环境的假说被提出，大量研究证明了干细
胞生态位区的存在。低氧浓度也是骨髓造血 niche 区域的特征之一，因此在
HSPC 体外培养过程中，低氧环境也起到非常重要的作用。
Smith 和Koller 等 应用3%-7%勺低氧环境进行造血细胞的体外培养，发现这些中度的低氧环境均 能增加各系
祖细胞的产率，且不影响它们的分化与成熟。并推测是因为其氧
项目背 景及研
究意义
浓度接近于体内造血环境的氧含量，比在常氧条件下的培养体系能减少氧自 由基的形成或增加细胞因子的生成。孙冰等进行了低氧和常氧条件下单核细 胞和CD34细胞的半固体和液体培养，计细胞总数和集落产率，发现体外低氧 环境能显着增加CD34造血干/祖细胞形成红系祖细胞的产率，且使其对细胞 因子的依赖性降低，并对早期红系祖细胞的维持有增强作用。体内造血过程 是一个非常复杂而周密的调节系统，低氧所致造血细胞增殖、分化和凋亡的 改变是由一系列细胞内信号转导、各种生物化学反应及相关基因表达改变的 综合结果。 有关微囊化基质细胞与造血干细胞共培养的研究，刘洋等在旋转壁式反 应器中进行了微囊化骨髓间充质干细胞支持脐血造血干 /祖细胞体外扩增研 究。但是到目前尚没有在低氧环境中采用微囊化的方法包埋 CD34细胞进行体 外扩增的报道。本研究正是基于目前对CD34■细胞和造血生态位区的最新认识， 从工程学的角度设计出一种利用微囊化的 CD34细胞在低氧环境下培养的策 略，实现造血干/祖细胞的有效体外扩增。
研究内
容和拟
解决的
关键问
题
研究内容：
1) 人源脐血造血干/祖细胞(HSPCS的体外分离和培养
将从健康足月分娩产妇采集到的脐带血(含抗凝剂)缓慢叠加到Ficoll淋巴分离液上，两者体积比为1:1~2:1。然后，进行密度梯度离心(2500r?min?* 1 2, 25 min)，吸取中间白膜层。将吸取到的细胞用含有10%胎牛血清的D-Hank' s
平衡盐溶液离心洗涤两次(1000 r?min ?1, 5 min)，之后调整密度接种到培养瓶中备用。
2) 脐带血CD34细胞的分离和培养
用免疫磁珠筛选分离法(magnetic activated cell sorting, MAC S分选CD34
