丹参毛状根生物反应器大规模培养的研究_邱德有

丹参毛状根的诱导及培养条件的优化作者：谈荣慧张金家赵淑娟来源：《中国中药杂志》2014年第16期[收稿日期] 2013-12-29[基金项目] 上海市教委预算内课题（2010JW20）[通信作者] *赵淑娟，Tel：（021）51322576，E-mail： zhaoshujuan@[作者简介] 谈荣慧，助理研究员，硕士，Tel：（021）51322495，E-mail：tanronghui405@[摘要] 为了建立丹参毛状根的诱导方法及液体培养体系，以发根农杆菌A4，LBA9402，15834为试验菌株分别侵染丹参无菌苗叶片，诱导丹参毛状根，PCR扩增筛选阳性株系，HPLC测定丹酚酸含量并在此基础上进一步优化毛状根的液体培养条件。

结果显示：3种发根农杆菌A4，LBA9402，15834均诱导出丹参毛状根，经PCR鉴定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中，其中发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高，质量分数分别为（3.27±0.37）%，（3.17±0.20）%；由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量较高，质量分数为（4.56±0.36）%；由发根农杆菌LBA9402诱导，pH为4.81的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量最高可达4.85%。

因此，以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培养基中培养的丹酚酸含量较高。

为进一步利用基因工程技术改良中药丹参的品质奠定了基础。

[关键词] 丹参毛状根；发根农杆菌；丹酚酸；HPLC中药丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根或根茎，具有祛瘀止痛、养血安神的功效[1]。

现代药理研究表明丹参对治疗心血管系统和血液系统的疾病有显著的作用，现已广泛使用临床[2]，其药效物质基础主要是脂溶性二萜醌类成分和水溶性酚酸类成分[3]。

浅谈Ri质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分研究中的应用-论文【关键词】人参；,Ri质粒；毛状根【关键词】人参；Ri质粒；毛状根Ri质粒介导的毛状根技术是20世纪80年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术。

它是将发根农杆菌含有的Ri质粒中的TDNA片段整合到植物细胞的DNA上，诱导出毛状根，从而建立起毛状根培养系统用于次生代谢物的生产［1］。

由于Ri质粒转化的毛状根具有生长快、易于培养、有用成分高、代谢通路表达完整的特点［２］，在利用生物技术生产药用植物有效成分领域，显示出极大的应用潜力和广阔的发展前景。

在利用Ri质粒介导的毛状根技术生产人参皂苷、人参多糖等次生代谢物方面已经做了大量的研究。

本文就该方面的研究作一综述。

1Ri质粒转化形成毛状根的机制［3~7］Ri质粒是位于发根农杆菌染色体之外的独立的双链环状DNA，一般在180～250kb之间，具有2个非常主要的功能区：TDNA区（TransferredDNAregion）和Vir区（virulanceregion）。

农杆碱型Ri质粒上的TDNA是不连续的，分为TLDNA和TR-DNA。

TRDNA上带有编码农杆碱合成酶基因（ags）和生长素合成酶基因（tms1和tms2），后者指导IAA的合成。

发根农杆菌侵染形成毛状根的过程可分为四个步骤：①发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成一种特殊的小分子化合物，如酚类化合物，从而诱导Ri质粒的Vir区基因群活化；②在Vir基因表达产生的酶的作用下，TDNA被切下；③TDNA转移到植物细胞并整合到植物基因组DNA；④TDNA在植物细胞中得到转录和翻译，发挥其机能，刺激植物细胞形成毛状根。

2Ri质粒介导的毛状根技术在获取人参药用成分研究中的应用众多的学者已经对人参毛状根体系的建立，不同的培养基成分、菌株、诱导子对毛状根生成以及对产生次生物质的影响，人参毛状根生理生化活性，利用人参毛状根合成其他药物成分以及人参毛状根的生物反应器培养等方面进行了大量的工作，为获取人参药物成分的工业化生产奠定了基础。

专利名称：一种三七毛状根的扩大培养以及三七皂苷的积累方法
专利类型：发明专利
发明人：郑淑红
申请号：CN201910089588.5
申请日：20190130
公开号：CN109566419A
公开日：
20190405
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种三七毛状根的扩大培养以及三七皂苷的积累方法，该方法包括如下步骤：（1）毛状根的活化；（2）一级摇瓶培养；（3）二级摇瓶培养；（4）低温胁迫和等离子体辐照处理；（5）生物反应器培养。

本发明通过对影响三七毛状根生长和次生代谢产物积累的主要因素的研究，摸索出了三七毛状根扩大培养的最优条件；通过对三七毛状根种子进行低温胁迫处理和等离子体辐照处理，并结合特定的培养基，达到促进三七毛状根生长和代谢，从而提高三七皂苷含量的目的，为三七毛状根的规模化生产以及三七皂苷的获得提供新途径。

申请人：郑淑红
地址：663000 云南省文山壮族苗族自治州开化镇开化南路三七药物产业园A8栋文山市苗乡三七实业有限公司
国籍：CN
代理机构：长沙新裕知识产权代理有限公司
代理人：赵登高
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专利名称：一种促进药用植物毛状根生长的培养器
专利类型：发明专利
发明人：薛涛,苏多猛,段永波,晁秋杰,薛建平,朱艳芳,盛玮,腾井通
申请号：CN202111151562.2
申请日：20210929
公开号：CN113711921B
公开日：
20220513
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种促进药用植物毛状根生长的培养器，包括反应罐，反应罐内设有多个培养装置，每个培养装置均包括放置在反应罐内的转轴，转轴侧壁上并排固定有多个喷头，每个喷头均通过一进水分管与进水总管连接，喷头外侧套设有毛状根支撑筒；每个培养装置的转轴均与用于带动其转动的驱动机构连接；反应罐上固定有用于将培养液输送到所述进水总管内，并通过所述喷头喷洒到毛状根上的喷淋装置，反应罐上还固定有空气输入装置。

本发明提供一种促进药用植物毛状根生长的培养器，适用于毛状根大规模培养，避免毛状根长成团状结构，同时将雾状的培养液均匀的喷洒到毛状根表面。

申请人：淮北师范大学
地址：235000 安徽省淮北市东山路100号
国籍：CN
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试论药用植物有效成分基因调控的研究进展
邱德有
【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》
【年(卷),期】2000(002)003
【摘要】本文综述了药用植物有效成分基因调控的研究进展.
【总页数】5页(P30-34)
【作者】邱德有
【作者单位】国林业科学院林业所
【正文语种】中文
【中图分类】R2
【相关文献】
1.药用植物组织培养生产有效成分的影响因素研究进展 [J], 张敏敏;陈玉梁;赵瑛;张运晖;罗俊杰
2.我国药用植物中保护肝脏有效成分的研究进展 [J], 张前军;康文艺;张龙;刘超
3.环境因子对耐荫药用植物生长发育及有效成分影响的研究进展 [J], 胡春凤;甘光标
4.氮素对药用植物有效成分累积的影响研究进展 [J], 罗佳琪;付立忠
5.基因调控技术提高药用植物细胞有效成分产量的研究进展 [J], 江湖;苏虎
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丹参毛状根T-DNA插入突变本的筛选和丹参GGPP 合酶基因的研究的开题报告一、研究背景丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是一种传统中药材，广泛应用于治疗心血管疾病、肝炎及类风湿性关节炎等疾病。

其中丹参的乳香酸、丹酚酸等花色苷类化合物是具有重要药理作用的有效成分。

然而，丹参中这些花色苷类化合物的含量较低，制约了丹参的应用和开发。

因此，开展丹参有效成分生物合成通路调控和代谢工程研究，是提高丹参产量和药理活性的重要途径。

二、研究内容此次研究的主要内容为：利用T-DNA插入突变技术筛选丹参中的GGPP合酶（geranylgeranyl diphosphate synthase）基因突变株，并研究其对花色苷类物质合成的影响。

GGPP合酶是花色苷类化合物生物合成途径中的关键酶。

通过筛选突变株，得到丹参中GGPP合酶的功能解析，对于理解丹参花色苷类化合物生物合成途径的调控机制、寻找提高丹参有效成分产量的策略和开发新型中药，具有重要的理论和实践意义。

三、研究方法1.丹参的种子进行表面消毒处理后，进行T-DNA插入突变。

2.通过PCR筛选出T-DNA插入突变体，进行酶活测定和HPLC分析花色苷类化合物的含量，筛选出丹参GGPP合酶基因突变株。

3.通过生物信息学方法进行丹参GGPP合酶基因的生物信息分析。

4.利用qPCR、Western blot等技术对突变株和野生型进行基因表达和蛋白质表达水平的比较分析。

四、研究意义及预期结果本研究将利用T-DNA插入突变技术筛选出丹参GGPP合酶基因突变株，并探究其对花色苷类化合物合成过程的影响，探索丹参有效成分生物合成途径的调控机制。

预计结果能为丹参有效成分生物合成途径的调控提供新思路，为丹参生产、开发提供科学依据。

丹参根结构建成及有效成分积累动态研究的开题报
告
研究题目：丹参根结构建成及有效成分积累动态研究
研究背景：
丹参是一种广泛应用于中药的植物，由于其含有丰富的生物活性成分，如丹参酮、丹酚酸等，对心血管疾病、肝病、肺气肿、中风等疾病有很好的预防和治疗作用。

而丹参的有效成分主要集中于根部，尤其是根茎和根皮部位，因此研究丹参根部结构建成及有效成分积累动态对于深入了解其药理作用和提高其药效有重要意义。

研究目的：
本研究旨在通过对丹参根部结构建成及有效成分积累动态的研究，探索丹参药效物质的积累规律，为丹参资源的合理开发和利用提供理论依据。

研究内容：
1. 丹参根部结构建成的解剖学研究
本项研究主要通过解剖学方法，观察比较不同生长期丹参根的形态结构以及制备薄切片，探究其组织学结构、细胞特征等。

2. 丹参有效成分积累动态的研究
本项研究主要通过高效液相色谱法和质谱法等化学分析方法，测定不同生长期丹参根部丹参酮、丹酚酸等有效成分的含量，揭示其含量变化趋势。

研究方法：
本项研究主要采用比较解剖标本、显微制片与化学物质分析相结合的方法，对丹参根部结构建成及有效成分积累动态进行综合研究。

研究意义：
本项研究可以为深入研究丹参有效成分积累规律以及制定合理的优化栽培方案提供依据，同时也为丹参的药理作用研究和丹参相关产品的质量控制提供参考。

丹参毛状根诱导条件的优化丹参是一种重要的中药材，具有活血化瘀、通经止痛等功效，在医药领域有着广泛的应用。

而丹参毛状根的诱导和培养为其有效成分的生产提供了新的途径。

为了提高丹参毛状根的诱导效率和质量，对诱导条件进行优化是至关重要的。

一、丹参毛状根诱导的基本原理丹参毛状根的诱导通常利用发根农杆菌与丹参外植体的相互作用来实现。

发根农杆菌中含有 Ri 质粒，其中的 TDNA 片段可以整合到植物细胞的基因组中，从而诱导毛状根的形成。

在合适的条件下，被感染的外植体能够产生大量的毛状根，这些毛状根具有生长迅速、次生代谢产物含量较高等特点。

二、影响丹参毛状根诱导的因素1、外植体的选择外植体的种类和生理状态对诱导效果有显著影响。

常用的外植体包括叶片、茎段、叶柄等。

一般来说，幼嫩的组织更容易被感染和诱导形成毛状根。

2、发根农杆菌菌株不同的发根农杆菌菌株具有不同的侵染能力和诱导效果。

一些菌株可能更适合丹参毛状根的诱导，需要通过实验筛选出最优的菌株。

3、侵染时间和浓度侵染时间过长或过短、农杆菌浓度过高或过低都可能影响诱导效率。

适宜的侵染时间和浓度需要通过预实验来确定。

4、共培养条件共培养的温度、光照、培养基成分等都会对毛状根的诱导产生影响。

例如，适宜的温度和光照条件能够促进农杆菌与外植体的相互作用，提高诱导成功率。

5、激素的添加在诱导培养基中添加适当种类和浓度的植物激素，如生长素、细胞分裂素等，可以调节细胞的分裂和分化，从而影响毛状根的诱导。

三、丹参毛状根诱导条件的优化策略1、外植体的优化对不同部位的外植体进行比较，选择诱导效率最高的外植体类型。

同时，注意外植体的采集时间和处理方法，以保证其生理状态良好。

2、发根农杆菌菌株的筛选选取多种发根农杆菌菌株，分别进行侵染实验，通过观察毛状根的诱导率、生长速度和形态等指标，筛选出最适合丹参的菌株。

3、侵染条件的优化通过设置不同的侵染时间梯度和农杆菌浓度梯度，确定最佳的侵染时间和浓度组合。

大规模培养的黄芪毛状根急性毒性研究
杜旻;金若敏;吴耀平;张海桂;刘涤;胡之璧
【期刊名称】《中草药》
【年(卷),期】1999(30)6
【摘要】对黄芪毛状根、野生黄芪和栽增黄芪的急性毒性进行了初步研究，结果表明三者均符合药典规定的毒性要求，可安全药用。

【总页数】2页(P444-445)
【关键词】黄芪;毛状根;毒性
【作者】杜旻;金若敏;吴耀平;张海桂;刘涤;胡之璧
【作者单位】上海中医药大学中药研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R282.710.5
【相关文献】
1.转透明颤菌血红蛋白基因黄芪毛状根急性毒性研究 [J], 王子艳;杜旻;吴晓俊;周吉燕;胡之璧
2.黄芪毛状根与黄芪药理作用的比较研究 [J], 金若敏;陈长勋;沈艳;王文群;郑志仁;刘涤;胡之璧
3.生物反应器与药用植物毛状根的大规模培养 [J], 陈岑曦;王伯初
4.丹参毛状根生物反应器大规模培养的研究 [J], 邱德有;宋经元;马小军;祁建军;张荫麟
5.应用毛状根转化技术获得植物次生代谢产物的研究Ⅰ.萝芙木毛状根的诱导与培养 [J], 孙敏;汤绍虎
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毛状根在植物次生代谢产物生产方面应用的研究进展
陈伟莉;牟旭鹏;刘冬影
【期刊名称】《黑河学院学报》
【年(卷),期】2010(001)004
【摘要】毛状根培养是生产植物次生代谢产物的新途径、新方法.对毛状根培养生产次生代谢产物的技术特点、毛状根诱导的分子机理以及利用毛状根生物反应器大规模生产植物次生代谢产物的研究进展进行阐述,为利用毛状根培养技术大规模生产有用药物提供参考.
【总页数】5页(P122-126)
【作者】陈伟莉;牟旭鹏;刘冬影
【作者单位】黑河学院,黑龙江,黑河,164300;吉林大学,再生医学科学研究所,长春,130021;黑河学院,黑龙江,黑河,164300
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.8
【相关文献】
1.毛状根在药用植物次生代谢产物生产中的应用概况 [J], 魏琦超;畅丽萍;周岩
2.Ri质粒介导的毛状根体系建立及其在植物次生代谢产物合成中的研究进展 [J], 刘彤;杨淑慎;方荣锋;张广昊;
3.Ri质粒介导的毛状根体系建立及其在植物次生代谢产物合成中的研究进展 [J], 刘彤;杨淑慎;方荣锋;张广昊
4.诱导子在药用植物毛状根生产次生代谢产物中的作用机理与应用 [J], 齐敏杰;梁
娥;张来
5.应用毛状根转化技术获得植物次生代谢产物的研究Ⅰ.萝芙木毛状根的诱导与培养 [J], 孙敏;汤绍虎
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诱导子对丹参毛状根中丹参酮类成分积累影响
王学勇;崔光红;黄璐琦;邱德有
【期刊名称】《中国中药杂志》
【年(卷),期】2007(32)10
【总页数】3页(P976-978)
【关键词】丹参毛状根;丹参酮类;活性成分;诱导子;唇形科鼠尾草属植物;次生代谢物;Salvia;繁殖能力
【作者】王学勇;崔光红;黄璐琦;邱德有
【作者单位】中国中医科学院中药研究所;中国林业科学研究院林业研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R282.6
【相关文献】
1.培养基中不同营养元素对丹参毛状根生长及丹参酮类积累的影响 [J], 沈双;张顺仓;杨东风;梁宗锁
2.脱落酸不同处理时间对丹参毛状根有效成分积累的影响 [J], 盛东峰;朱自学
3.生物与非生物诱导子协同作用对丹参毛状根培养生产丹参酮的影响 [J], 晏琼;胡宗定;吴建勇
4.茉莉酸甲酯对丹参毛状根中丹参酮类成分积累和释放的影响 [J], 王学勇;崔光红;黄璐琦;邱德有
5.生物和非生物诱导子对丹参毛状根培养生产丹参酮的影响 [J], 晏琼;胡宗定;吴建勇
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