高效液相色谱仪流动相及样品的预处理

岛津液相色谱仪使用注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。

对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。

清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。

9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。

更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

液相色谱柱使用经验谈色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。

但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

1、样品的前处理：a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

高效液相色谱仪操作三要点高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。

同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC 也已成为不可或缺的分析仪器。

和其它分析仪器一样，你若想让HPLC 很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。

而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。

大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。

但要是总结归纳一下，最重要的有三点：脱气、过滤和冲洗。

本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC 分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮助。

更欢迎有经验的专家介绍使用经验，提出好建议。

一、脱气流动相脱气对于避免HPLC 系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。

HPLC 系统内是不希望有气泡存在的。

HPLC 泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。

如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。

有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。

当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。

但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。

为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。

当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。

紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。

有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS 不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。

2020药典关于0512 高效液相色谱法标准公示稿一、引言本标准规定了采用高效液相色谱法对某物质进行检测的方法。

本标准适用于药品、食品和化妆品等领域的物质分析。

本标准是在2020药典的基础上制定的，旨在提高检测的准确性和可靠性，为相关行业提供更加精确的检测依据。

二、仪器和试剂1. 仪器：高效液相色谱仪，配备有紫外检测器。

2. 试剂：甲醇、乙腈、水等色谱纯度试剂，以及其他所需试剂。

三、实验步骤1. 样品准备：将待测样品进行预处理，使其符合高效液相色谱分析的要求。

2. 流动相制备：根据需要选择合适的流动相，并进行过滤和脱气处理。

3. 色谱柱选择：根据待测物质的性质选择适宜的色谱柱。

4. 检测条件设定：根据待测物质的性质，设定合适的流速、检测波长等参数。

5. 进样：将处理好的样品注入高效液相色谱仪中进行分析。

6. 数据处理：采集色谱图，并使用相关软件进行数据分析和处理。

四、结果计算和表示根据高效液相色谱图，对峰面积进行积分，并计算待测物质的含量。

结果表示应符合相关规定，如单位、有效数字等。

五、精密度和准确度1. 精密度：在同一实验条件下，对标准品进行多次测定，计算其相对标准偏差。

2. 准确度：采用已知纯度的对照品进行加标回收实验，计算回收率。

六、溶液稳定性考察待测物质在一定时间内的稳定性，以确保检测结果的可靠性。

可对放置不同时间的样品进行测定，观察其含量变化情况。

七、对照品纯度要求用于本方法检测的对照品应符合一定的纯度要求，以确保结果的准确性。

建议使用高纯度对照品进行测试和分析。

八、测试数据及图谱1. 测试数据：记录每次测定的峰面积、浓度等数据，以便后续数据处理和分析。

2. 图谱：记录色谱图，并注明各峰对应的物质。

九、检验规则1. 检验批次：同一批次样品应作为一个检验批次，按照相同的检测方法进行检测。

2. 异常值的处理：对于异常值，应进行复核或重新测定，以确保结果的准确性。

3. 检验报告：检验报告应包括样品信息、检测方法、结果数据等内容，并由检验人员签字或盖章。

高效液相色谱仪的操作步骤高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术。

它利用液体流动相和固定相之间的相互作用，将样品中的混合物分离出来，并通过检测器进行定量分析。

本文将介绍高效液相色谱仪的具体操作步骤。

1. 准备工作在进行高效液相色谱仪的操作之前，首先需要进行一些准备工作。

检查色谱柱是否安装正确，确保色谱柱是干净的，并检查流动相的配制是否准确。

2. 样品制备根据需要分析的物质，准备好待测样品。

样品制备可以包括溶解样品、过滤样品等步骤，以确保样品的纯净度和稳定性。

3. 仪器开机将高效液相色谱仪接通电源，打开仪器的电源开关。

等待仪器初始化，并确保仪器各个部分正常工作。

4. 设置参数在仪器上设置分析所需的参数。

包括选择适当的检测器类型和检测波长、设置流量、温度等。

5. 启动系统启动高效液相色谱仪系统，等待系统稳定。

通常需要一段时间使得流动相在管路中充分平衡，并确保流量稳定。

6. 校正进行色谱柱的校正。

校正过程包括流量校正、波长校正等。

通过校正可以保证仪器输出结果的准确性和可靠性。

7. 注射样品将样品通过注射器引入色谱柱中，控制样品的注射量，通常在微升至毫升的量级。

确保样品的注射量稳定和准确。

8. 分离分析开始运行高效液相色谱仪系统，进行样品的分离与分析。

在此期间，流动相通过色谱柱，将样品中的化合物根据它们与固定相之间的相互作用进行分离。

9. 监测结果通过检测器对分离后的化合物进行监测。

根据检测器的信号，可以得到每个化合物的峰面积、保留时间等数据。

10. 数据处理将监测到的信号输入到数据处理软件中，进行结果的计算和分析。

通常可以得到各个化合物的峰高、峰面积等数据，从而实现对样品的定量分析。

11. 关机分析结束后，关闭高效液相色谱仪的电源开关，并进行必要的清洗和维护工作。

确保仪器的正常运行，并延长其使用寿命。

总结：高效液相色谱仪的操作步骤涵盖了仪器准备、样品制备、仪器设置、校正、样品注射、分离分析、结果监测和数据处理等多个方面。

高效液相色谱法操作步骤
高效液相色谱法的操作步骤如下:
1. 过滤流动相并根据需要选择不同的滤膜。

溶剂必须为色谱纯，且溶剂及样品必须过膜（0.45μm）。

超声脱气30分钟以上。

2. 用流动相冲洗金属过滤器，然后将过滤器浸入储液罐的流动相中。

有一段时间没用或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。

3. 将储液罐放置在一定的高度，以避免由于搬运和其他操作人员的移动而造成不必要的跌落。

4. 然后按以下顺序依次启动高效液相色谱仪：泵→检测器→高效液相色谱软件→设置软件参数，如分析时间、检测波长、流速等。

5. 启动泵，运行5分钟，主要是为了排除系统中的气泡，结束后关闭所有排气阀。

6. 然后按照预先计划的速度，以固定的速率，如1mL/min左右，运行流动相，走基线，直到基线平稳。

7. 基线平稳后，在软件中设置样品的运行参数，如流速和分析时间等。

分析时间会因样品、流速、柱长等因素变化。

8. 设计走样方法。

9. 在进样和进样后操作的过程中，需要及时调整和监控各项参数。

高效液相色谱样品预处理步骤1. 样品准备在准备高效液相色谱样品时，需要确保样品的稳定性，防止样品在分析过程中发生变化。

因此，在样品准备过程中需要注意以下几点：（1）选择合适的样品存储容器，避免样品被污染或发生变化；（2）确保样品在分析前达到室温，以避免样品在注射到色谱柱时产生气泡；（3）注射适量的样品，以避免色谱柱被过度磨损或样品过载。

2. 样品过滤在进行高效液相色谱分析前，需要将样品通过过滤器进行过滤，以去除样品中的固体杂质或悬浮物，从而防止其对色谱柱的堵塞或损坏。

通常使用的过滤器有不同规格的筛网或滤膜。

3. 样品衍生化在一些情况下，需要对样品进行衍生化处理，以便更好地进行高效液相色谱分析。

衍生化处理可以将样品中的某些化合物转化为更易分析的形式，例如将某些极性化合物转化为非极性化合物，使其更适合用有机溶剂进行洗脱。

4. 样品稀释在某些情况下，需要将样品进行稀释，以便更好地进行高效液相色谱分析。

过浓的样品可能会导致色谱峰过宽或重叠，影响分析结果的准确性。

通常使用的的是溶剂或水进行稀释。

5. 样品进样在进行高效液相色谱分析时，需要将样品通过进样针注入到色谱柱中。

在进行进样时，需要注意以下几点：（1）注射适量的样品，以避免色谱柱被过度磨损或样品过载；（2）确保进样针的清洁和干燥，以避免对分析结果产生干扰。

6. 样品分离在将样品注入到色谱柱后，需要对其进行分离。

通常使用的的是高压泵将流动相通过色谱柱，将样品中的各个化合物进行分离。

在进行分离时，需要注意以下几点：（1）选择合适的流动相，以便将样品中的各个化合物进行分离；（2）调整流动相的流速和比例，以便获得更好的分离效果。

7. 检测器检测在分离后的各个化合物通过色谱柱流出时，需要使用检测器进行检测。

常见的检测器有紫外可见光检测器、电导检测器、荧光检测器等。

检测器可以提供样品的信号，并记录下各个化合物的在色谱图中的保留时间。

8. 数据处理在检测器检测完成后，需要对数据进行处理。

高效液相色谱仪的操作步骤液相色谱解决方案高效液相色谱仪操作步骤：1）．过滤流动相，依据需要选择不同的滤膜.2）．对抽滤后的流动相进行超声脱气10—20分钟。

3）．打开hplc工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4）．进入hplc掌控界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5）．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。

冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。

冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6）．调整流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000、点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，察看基线的情况。

7）．设计走样方法。

点击file，选取se—lect users and methods，可以选取现有的各种走样方法。

若需建立一个新的方法，点击new method。

选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，依据需要而不同。

选完后，点击protocol。

一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2—5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading—inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8）．进样和进样后操作。

选定走样方法，点击start。

进样，全部的样品均需过滤。

方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。

全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9）．关机时，先关计算机，再关液相色谱。

10）．填写登记本，由负责人签字。

注意事项：11）．流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。

脱气后的流动相要当心振动尽量不引起气泡。

12）．柱子是特别脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

13）．全部过柱子的液体均需严格的过滤。

14）．压力不能太大，可以不要超过2000 psi。

液相色谱流动相说明流动相相当于液相的血液，可以想象对液相的紧要程度。

高效液相色谱仪的操作流程和注意事项引言：高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种重要的分析仪器，广泛应用于化学、生物、医药等领域。

掌握正确的操作流程和注意事项，对保证分析的准确性和结果的可靠性至关重要。

下面将详细介绍高效液相色谱仪的操作流程和注意事项。

一、仪器准备在开始操作高效液相色谱仪之前，需要进行一些准备工作。

首先，检查仪器是否正常工作，例如电源是否正常接通，各个模块是否连接牢固等。

其次，确保色谱柱处于良好的工作状态，即没有泄漏和堵塞等问题。

最后，根据需要，选择合适的检测器，并校准相应的参数。

二、样品准备和进样样品的准备是操作高效液相色谱仪的关键一步。

首先，根据样品的性质选择合适的溶剂体系，并将样品完全溶解。

其次，为了提高分析的准确性，通常需要对样品进行预处理，例如磷酸酯酶的样品需要经过脱磷酸处理。

最后，将样品装入进样瓶中，根据仪器的要求设定进样量。

三、流动相的选择和准备流动相是高效液相色谱仪中的关键因素之一。

在选择流动相时，需要考虑样品的性质以及分析的目的。

常见的流动相包括有机溶剂、水以及它们的混合溶液。

在选择后，需要准备流动相，并进行除气处理以去除气泡。

此外，还要注意流动相的质量，例如pH值、浓度等。

四、色谱条件的设置色谱条件是操作高效液相色谱仪的关键之一。

根据分析的目的和样品的性质，需要设置合适的参数，例如流速、温度、梯度等。

在设置前，需要根据样品性质选择合适的色谱柱，并设定相应的温度以优化分离效果。

此外，还需要根据检测器的要求设定相应的参数。

五、数据采集和结果分析在操作高效液相色谱仪时，需要进行数据采集和结果分析。

首先，确保数据采集系统正常工作，并根据仪器的要求进行设定。

其次，启动数据采集并进行监控，及时记录实验过程中的各项指标。

最后，对采集的数据进行处理和分析，例如峰面积的计算、峰形的分析等。

注意事项：1. 严格按照操作流程进行操作，避免任意更改设置。

高效液相色谱仪操作步骤1.准备工作：a.检查设备是否正常运转，所有零件是否安装和连接正确。

b.检查每个必需的溶液和试剂是否充足并且符合规定的质量标准。

c.检查色谱柱是否装配完好，并根据要进行的分析校准适当的流量和压力范围。

d.打开色谱软件，并设置所需的分析方法和参数。

e.开始预热色谱柱直到达到所需的温度。

2.样品制备：a.准备待检测样品的溶液或提取物，并进行必要的预处理步骤，例如固相萃取、浓缩、稀释或离心等。

b.将样品溶液通过0.22微米滤膜过滤，以去除杂质、微粒和可能堵塞色谱柱的颗粒。

3.样品进样：a.打开进样器，并选择合适的样品进样模式（如定量进样或自动进样）。

b.使用微量注射器或自动进样器将样品注入进样器，并确定进样量符合分析方法的要求。

4.色谱柱选择：a.根据样品特性和分析目的选择合适的色谱柱类型（如反相、离子交换、大小排阻等），尺寸（长度和内径）和填充材料等。

b.根据样品的pH值调节移动相的酸碱度，以满足分析要求和保护色谱柱。

5.色谱条件设置：a.设置流量速率，根据色谱柱的额定最大流速和样品的分离要求来确定。

一般来说，较高的流速可提高分离速度，但也会降低分离效果。

b.设置柱温，并确保温度稳定在所需的分析条件下。

c.设置检测器的参数，如波长、增益、灵敏度等，以适应待测试样品的检测需求。

6.分析运行：a.开始进样和运行色谱，确保流量和压力稳定。

b.监测色谱峰形的变化和信号强度，以评估分离速度和效果。

c.记录每个样品的保留时间和峰高（面积），并进行相应的数据处理和分析。

7.数据处理：a.使用色谱软件导出和处理分析数据，如生成色谱图、峰面积测定、峰高度测定、定量计算等。

b.根据实验目的和要求，对分析数据进行统计学分析、校正和解释。

c.对数据进行结果汇总、报告撰写和存档。

8.后期维护：a.定期检查和维护仪器，如清洁色谱柱、更换零件、校准仪器、更换溶液等，以确保仪器的正常运行和结果的准确性。

b.对废液和废品进行妥善处理，符合环境保护要求。

高效液相色素仪操作方法
高效液相色谱仪是一种用于分离、分析和测量化学物质的仪器。

以下是一般的高效液相色谱仪的操作方法：
1. 准备样品：根据需要进行样品预处理，如提取、浓缩或稀释，确保样品适合进样。

2. 准备色谱柱：根据分析需求，选择合适的色谱柱，并安装到色谱仪中。

3. 准备流动相：根据分析需求，配置合适的流动相溶液，并通过色谱仪的泵系统将其泵入色谱柱中。

4. 设置检测器：根据分析需求，选择合适的检测器，并对其进行设置和校准。

5. 设置色谱条件：根据分析需求，在色谱仪的控制面板上设置合适的色谱条件，如流速、温度和梯度程序等。

6. 进样：将样品注入色谱仪的进样口，并确保样品完全进入色谱柱中。

7. 运行色谱：启动色谱仪的运行程序，监控色谱曲线和检测信号，并记录数据。

8. 数据分析：根据色谱图和检测信号，对样品进行定性和定量分析，计算结果。

9. 清洗和维护：运行完毕后，及时清洗色谱柱和色谱系统的各个部件，并进行必要的维护和保养。

请注意，以上只是一般的高效液相色谱仪的操作方法，具体的操作步骤可能会因仪器型号和实验需求而有所不同。

在操作前，建议先仔细阅读仪器的操作手册，并遵守相关的安全操作规程。

高效液相色谱基本流程高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）的基本流程可以概括为以下步骤：1、流动相制备与脱气：1.首先，根据实验要求配制合适的流动相（通常为有机溶剂与水的混合物），并对流动相进行过滤（常用0.2μm或0.45μm的滤膜过滤）以去除微粒杂质。

2.过滤后的流动相还需要进行超声脱气处理，以减少气泡的产生，因为气泡会干扰压力稳定性和检测结果。

2、系统启动与预洗：1.打开HPLC系统电源，开启高压输液泵，连接流动相管道，通过排空和冲洗系统管路，排除系统内的空气并使流动相充满整个系统。

3、色谱柱预处理：1.如果色谱柱是新柱或长时间未使用，需按厂家推荐方法进行活化处理，确保色谱柱内部填料性能良好。

4、样品准备与进样：1.根据待测样品性质，将其适当稀释、过滤或离心处理，然后通过自动进样器或手动注射器注入到样品环中。

5、分离与洗脱：1.当样品注入系统后，流动相携带样品通过色谱柱。

由于各组分在固定相（色谱柱填料）和流动相之间的分配系数不同，它们在色谱柱内按各自的速度进行分离。

6、检测与记录：1.分离出的各组分依次通过检测器（如紫外/可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器、质谱检测器等），其中的浓度变化会被转化为电信号。

2.这些信号由记录仪（现代HPLC系统中通常是电脑工作站）接收并转化成色谱图，即时间与响应强度的关系曲线。

7、数据分析：1.对得到的色谱图进行定性分析（识别峰对应的化合物）和定量分析（计算各组分的含量）。

8、系统清洗与关机：1.完成所有样品分析后，使用适宜的清洗液清洗色谱柱和系统，最后关闭HPLC系统及相关设备。

以上就是高效液相色谱仪的基本工作流程，每个步骤都必须严格按照实验室规程进行，以确保实验结果准确可靠。

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项一、操作步骤：1.开机前先将流动相过滤和超声：水流动相用混合滤膜（0.2μm）过滤,有机流动相用有机滤膜过滤，之后超声脱气15-20分钟。

（过滤的目的是除去流动相里的杂质，以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱；超声的目的是排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响柱效能）注：试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜，第一次使用时感觉效果不好，于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。

2.超声结束后，将流动相放置到规定位置（1号泵接水流动相，2号泵接有机流动相），开机逐个排气（先启动泵，排气结束后再打开检测器）。

3.排气结束后，关闭所有排气阀。

先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，基线走稳之后，再打开水流动相（注意：水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min），继续走基线，直到基线平稳。

注意：实验结束后，再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，冲出色谱柱内残留的样品物质，预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内，导致下次使用难以冲出，色谱柱柱压偏高，基线不稳，出现大量鬼峰。

（不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同）4.走基线时，应将进样阀处于Load状态，用注射器进样时应快速进样，进样后将进样阀立即扳回到Inject状态，此时液相系统开始进入采样状态。

采样结束后，可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑，也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。

二、使用中常见的问题及注意事项1.过滤时有时会出现流动相漏液。

可能的原因是滤膜放置不正确（有点偏）和接头有点错位，导致流动相从缝隙中漏出。

注意：操作时，应先向滤瓶内倒入少量流动相，观察是否漏液并开始过滤，若未漏液，再向滤瓶中添加流动相。

2.超声时，瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面，否则流动相内的气体可能无法排出液体，气体仍然残留在流动相内，以致开机排气时无气泡排出。

3.开机排气结束后，应先将流动相流量调小，再关闭排气阀，否则会导致柱压瞬间升高超过压力上限，致使泵停止工作。

高效液相色谱仪的数据处理方法介绍高效液相色谱仪(HPLC)是应用高效液相色谱原理，主要用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定的和分子量大的有机化合物的仪器设备。

它由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

HPLC广泛应用于生命科学、食品科学以及环境研究中。

高效液相色谱仪（HPLC）是一种高效的色谱分析仪器，它的分离效率高于传统色谱仪，可用于分析不同类型的样品。

高效液相色谱仪通过流动相、固定相和样品之间的相互作用实现对不同成分的快速分离和定量分析。

高效液相色谱仪的记录样品通过检测器吸光度变化引起的电信号变化，从而产生色谱图，**结果取决于后期色谱数据处理系统的数据处理。

以下是两种常用的高效液相色谱仪数据处理方法。

光谱处理后可以制作校正曲线。

校正曲线是数据处理的重点。

它是一个标准，使信息和数据的标准光谱图处理样品光谱图。

高效液相色谱仪的校正是通过分析制备的标准样品来确定计算绝对组分浓度的响应系数的过程。

1.外标法：外标法是在空白样品中加入一定量的标准物质作为对照样品，与未知样品同时进行样品处理和检测，并计算出被检测成分的浓度的定量方法。

根据对照品响应值与标准品浓度函数的关系，测定未知试样中的成分。

2.内标法：内标法是将一定重量的纯物质作为内标物加入一定量的被测样品混合物中，对含有内标物的样品进行高效液相色谱仪分析，测定峰面积和相对含量。

分别测定内标物和受试物的有效校正系数，并按公式计算受试物的含量。

高效液相色谱仪使用注意事项1、使用者上机前首先须经过管理老师的同意，须认真履行仪器使用登记制度，出现问题应及时向老师报告。

2、须自备分析柱和流动相溶剂。

3、流动相：须使用色谱纯级溶剂，样品溶液和流动相需用0.45µm 滤膜过滤。

若是使用V ARIAN色谱仪，流动相须首先赶气40～60分钟。

4、进样：一定要使用平头微量进样针进样。

对一般样品而言，进样体积需大于定量环的2.5倍～4 倍则更加保险。

5、请正确开关机，顺序如下：打开计算机（Agilent 1100还须先运行Bootp Server程序）→打开HPLC 各模块电源→待各模块自检完成后，打开化学工作站→打开Purge阀，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止→关上Purge阀→进行数据分析方法编辑和数据采集方法编辑→用流动相冲洗和平衡系统和分析柱（更换溶剂后应以较长时间平衡系统）→关机时，先关闭化学工作站，再关HPLC 各模块电源和计算机。

6、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相。

7、请在每次分析时检查并记录压力是否在正常范围；每次使用完毕后请清洗系统：先以适当比例水和ACN 或MeOH混合溶液清洗20～30分钟，再以100％ACN 或MeOH 清洗10～20分钟，最后应将有机溶剂保留在系统中。

当流动相中使用了无机盐、酸等缓冲盐物质，在分析结束后，应先用纯水“purge”脱气机管路冲洗5分钟，再用95％水和5％ACN 或MeOH清洗色谱柱30～40分钟后，再以100％ACN 或MeOH 清洗10～20分钟，最后应将有机溶剂保留在系统中。

冲洗过程中关闭D灯、W灯。

8、为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。

通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。

高效液相色谱仪使用方法
高效液相色谱仪（HPLC）是一种常用的分析仪器，用于分离
和定量分析化合物的混合物。

以下是HPLC的基本使用方法：
1. 样品准备：将待分析的混合物或溶液准备好，通常需要进行前处理，例如过滤、稀释或提取。

2. 系统准备：打开色谱仪的电源，启动仪器，确保所有组件处于正常工作状态。

检查液相、气相和其他溶剂的供应，并确保其质量良好。

3. 进样：将样品注射器连接到色谱柱，并根据实验要求设置注射器体积。

将样品注射器插入进样口，并将样品注入到色谱柱。

4. 创建梯度：根据分析要求，创建一个梯度程序。

这涉及到设置流动相的组成和梯度变化的速率。

5. 运行分析：点击开始按钮，启动分析过程。

色谱系统将自动进行溶剂梯度变化，使样品中的化合物逐步从色谱柱中分离出来。

6. 数据采集和分析：在分离过程中，色谱仪将采集到一系列数据点，包括峰高、峰面积、保留时间等。

使用相关的数据处理软件，可以对这些数据进行处理和分析。

7. 清洗和维护：在分析完成后，需要进行系统的清洗和维护。

这包括冲洗色谱柱、清理进样器和其他组件，并储存色谱仪在
正确的环境条件下。

以上是高效液相色谱仪的基本使用方法。

具体的使用流程和操作步骤可能会有细微的差异，取决于具体的仪器品牌和型号。

建议在使用前仔细阅读和理解相关的操作手册和使用说明。

液相色谱使用中样品预处理注意的几个环节高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快和应用范围广等特点,特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。

目前高效液相色谱已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离技术,是分析化学家和生物化学家手中用于解决他们面临的各种实际分析和分离课题必不可少的工具之一。

虽然在检测分析中使用了昂贵的、性能优越的高档精密仪器,但是由于在样品的前处理,标准溶液的制备,样品液的测定,分析中的污染,仪器常见故障等等问题上的不注意,而引起大的系统误差,使整个测定分析失败。

现就液相色谱分析的应用中样品预处理注意的几个环节,作简要分析,以达到更好的检测效果。

1 样品预处理方法样品预处理应包括进样前的一切操作。

除了称重、溶解、稀释等步骤外,样品需要: ①过滤; ②萃取; ③衍生化(柱前衍生) ; ④液相色谱(低压柱层析) 。

这些操作可以是手工进行或实行自动化操作。

样品预处理的目的是除去干扰物、增加检测器灵敏度(富集) 、保护色谱柱等。

样品预处理同时也是为了避免色谱分离故障,其中样品萃取是关键的一步,要从大量的干扰物中萃取出微量组分难度极大。

有些样品经预处理后还不能作进样分析,需进行衍生化处理,使一些无紫外吸收或无荧光的组分,经过衍生化后能用紫外和荧光检测器检测,这样既提高了灵敏度,又改善了分离度(质量变化) 。

样品预处理的同时也会带来一些问题,如样品损失、样品被污染、衍生化反映不完全或多种反应物生成等。

衍生反应常会影响试验的精确度,或者在整个样品预处理过程中带来误差。

用于液相色谱分析的样品溶液必须均匀而无颗粒,有颗粒会损坏进样器并阻塞柱头。

处理好的样品在准备上柱前应对准光线摇动,检查样品溶液中有无颗粒。

只要看到颗粒、混浊或乳化,就应过滤一下,过滤膜要能截留住015μm 以上的颗粒,样品过滤的过程中可能引起:样品被污染,因过滤吸附降低样品组分的含量,样品溶剂挥发引起误差。