植物细胞培养

• 研钵中放入10 g叶片和40 ml研磨介质 (20 uM蔗糖+10 uM MgCl2+20 uM TrisHCl缓冲液)，轻轻研磨，匀浆用双层细 纱布过滤，滤液经过低速离心，游离细 胞就会沉降到试管底部，得到纯化细 胞。
方法1:
撕去表皮
露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞
方法2：叶片研碎、离心
加研磨介质
• 操作简便、重复性好、群体大
二：单细胞的分离
• 可以获得单细胞的来源：
• 由植物器官分离单细胞 • 由愈伤组织分离单细胞
1 由植物器官分离单细胞
• 叶片是分离单细胞的最好材料 • 叶片分离单细胞的方法：
• 机械法 • 酶解法
• 1）机械法：
• 用刀片刮叶片 (花生成熟叶片) • 叶片研碎、离心法
• 方法：
• 把含琼脂的培养液加到小三角瓶中，使成1cm厚，高压灭菌后备 用。在无菌条件下，取处于活跃生长期的约1cm2大小的愈伤组织 块，安放在三角瓶中固体培养基上的中央部位，并在愈伤组织块上 放一片约1cm2的无菌滤纸片，将其在培养室中放置过夜，使滤纸充 分吸收从组织块渗出来的营养成分。然后将分离出的单个细胞接种 到滤纸上面进行培养。待2~3个月后即可从滤纸上直接转移到新鲜 培养基上，得到单细胞无性系
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该方法可在暗 视野（或相差 显微镜下清楚 地观察到活细 胞的各种变 化，甚至还可 以观察到线粒 体的变化。 由于培养基 少，营养、水 分和PH变动 大，培养细胞 仅能短期分裂
第八讲 植物细胞培养
2012年秋季
上一讲内容回顾
• 1）什么是单倍体？单倍体植株？ • 单倍体（Haploid）：具有配子染色体数目的 细胞、组织或个体 • 单倍体植株（Haploid Plant）：由单倍体细 胞分化、生长出来具有配子体染色数的植株
• 2）单倍体细胞培养的途径？
• 雌配子体培养（未受精的胚珠/子房培养） • 花药培养 • 花粉培养
轻轻研磨 过滤、离心
• 机械法的优缺点：
• 优点：完整细胞不受酶的伤害，无需胞质分离，对于生理生 化研究较为理想 • 缺点：细胞产量低，不易获得大量活性细胞；仅适用于只有 薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少的叶片类型
• 2）酶解法
• 常用酶：果胶酶 • 添加0.8%甘露醇及1% 硫酸葡聚糖钾
加果胶酶
• 3）什么是雄核发育途径？其启动机制是？
• 在合成培养基上，以花药或花粉为外植体，改变花粉 的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行 分裂、分化、最终发育成完整植株的发育途径。 • P花粉及饥饿处理
• 4）适合单倍体培养的花粉发育阶段？花粉单 倍体植株的形态发生方式有哪两类？
• 花粉离体培养时，雄核发育最适宜的时期一般是第 一次有分裂或之前 • 胚状体发育途径及愈伤组织发育途径
三：植物细胞培养的分类
• 单细胞培养
• 细胞的悬浮培养
1 单细胞培养
• 对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂 增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、 根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术 • 培养方法：
• 平板培养法(Plating Method) • 看护培养法(Nurse Culture) • 微室培养法(Microchamber Culture) • 纸桥培养法(Paper Wick Method)
• 此法简单易 行，易于成 功，但不能在 显微镜下直接 观察细胞生长 过程
• 3）微室培养法
• 悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的 固体培养基中的培养方法
• 方法：
• 将洗净的盖玻片与载玻片在酒精灯火焰上消毒，冷却后按盖 玻片大小在载玻片上涂一圈四环素眼膏。 • 将细胞悬浮液滴一小滴在载玻片上，然后在四环素眼膏上放 一小段毛细管，将消毒后的盖玻片盖在四环素眼膏的框子沙 锅内，使其与眼膏紧密接触，在盖玻片与载玻片之间造成一 密闭的小室，这小室通过一段毛细管与外界通气，盖玻片盖 上后要使它与细胞悬浮液滴相接触。 • 带有培养物的微室可以按需要放在培养箱或培养室中，温度 26~28℃，光照或黑暗的条件下进行培养。 • 观察或照相时一定要在同一温度下进行。
• 1）平板培养法：
• 分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿 内的培养方法称为平板培养法
• 方法：
• 将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化 分散纯化的细胞，经计数及稀释（悬浮液中细胞的 密度调整到103~105个/ml），接种到加热熔化而刚 冷却至35℃左右的固体培养基中充分混匀，倾入培 养皿中，石蜡密封，于25℃培养，约20天后细胞即 可生长成团。统计生长情况
• •
平板培养的效果一般用植板率衡量。植板率是指已形成细胞团的单 细胞与接种总细胞数的百分比 植板率=（每个平板中所形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞 数）Χ100%
• 2）看护培养法
• 从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每 个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈 伤组织上进行培养的方法
பைடு நூலகம்
• 5）花药/花粉培养在育种中的应用有哪些？
• 克服后代分离，缩短育种周期 • 提高目标基因型的选择效率 • 用于诱变育种 • 获得超雄株
本讲内容
• 概念 • 单细胞的分离 • 植物细胞培养分类 • 植物细胞培养的应用
一：定义
• 植物细胞培养（plant cell culture）：指对 植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或 小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再 生植物的技术 • 特点：
过滤 、离心
• 酶解法的优缺点：
• 优点：可以得到高纯度的叶肉细胞；产量高；细胞 不易破 • 缺点：细胞受到酶伤害；细胞受到质壁分离影响； 对于，大麦、小麦和玉米很难通过酶解法使细胞分 离（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间形 成一种互锁结构）
2 由愈伤组织分离单细胞
• 将未分化、易碎散的愈伤组织—转移到装有适当液体 培养基的三角瓶中—置于水平摇床以80-100 rpm振荡 培养—获得悬浮细胞液—用孔径200 mm的细胞筛过滤 除去大块细胞团—再以4000 rpm速度离心—除去比单 细胞小的残渣碎片—获得纯净的单细胞悬浮液 • 方法简便、易于获得大量高质量的单细胞，应用广泛