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一、猪胰蛋白酶制备（一）猪胰蛋白酶原的提取∙猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。
∙加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升）。
∙加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。
（二）胰蛋白酶原激活∙向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液。
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1M CaCl2。
2．用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。
3．活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。
（三）胰蛋白酶的分离1．将已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。
2．滤液按250克/升加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。
（四）胰蛋白酶的结晶1．将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。
2．用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。
3．放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1 /5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。
鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化摘要：鸡卵类粘蛋⽩是由鸡卵清中制得的⼀种糖蛋⽩，具有强烈的抑制胰蛋⽩酶的作⽤，常⽤于胰蛋⽩酶的酶学性质的研究和胰蛋⽩酶的亲和层析纯化制备。
胰蛋⽩酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋⽩酶的⼀种，EC3.4.21.4。
在脊椎动物中，作为消化酶⽽起作⽤，⽽且还能限制分解糜蛋⽩酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作⽤。
本实验以鸡蛋清为原料，提取猪胰蛋⽩酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋⽩，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶上，制成鸡卵粘蛋⽩的亲和吸附剂，然后通过亲和层析直接从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋⽩酶。
并设计了酶活性测定以对纯化过程进⾏监测和对纯化效果进⾏评价；设计了电泳实验对制备的猪胰蛋⽩酶进⾏纯度和分⼦量的测定。
关键词：鸡卵粘蛋⽩；胰蛋⽩酶；亲和层析；分离纯化；酶活性。
鸡卵粘蛋⽩（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的⼀种糖蛋⽩，⾄今还未能获得单⼀组分，在电泳⾏为上常呈现不均⼀性。
不同来源的卵类蛋⽩末端基有很⼤差别，鸡卵类蛋⽩N-末端基为丙氨酸。
卵类粘蛋⽩在中性活酸性溶液中对热和⾼浓度的脲是相当稳定的，⽽在碱性溶液中⽐较不稳定，尤其温度较⾼是易迅速失活，在50%丙酮或10%三氯⼄酸溶液中仍有较好的溶解度。
它们的等电点有⼀定的范围，⼤致在3.9—4.5之间。
鸡卵粘蛋⽩除对⽜和猪的胰蛋⽩酶有强烈的抑制作⽤外，对枯草杆菌蛋⽩酶也有⼀定的抑制作⽤，但对胰凝乳蛋⽩酶⽆抑制作⽤，对⼈的胰蛋⽩酶也⽆明显抑制作⽤，因此常⽤于胰蛋⽩酶酶学性质的研究。
在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋⽩酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋⽩酶进⾏分离纯化。
1材料与⽅法1.1材料与试剂市售鲜鸡蛋，10%TCA，1mol/L NaOH ，5mol/L NaOH ，1mol/L HCl，5mol/L HCl，丙酮（A.R），葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25)，0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，DEAE-52离⼦交换纤维素，离⼦交换剂（0.5mol/L HCl ，0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl ），洗脱液（0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液）,透析袋（φ2.7cm）,标准胰蛋⽩酶溶液（1mg/ml），0.05mol/L PH7. 8 Tris- HCl缓冲液，BAEE底物缓冲溶液（0.05mol/L CaCl2- 0.05mol/L PH8.0 Tris- HCl缓冲液），1mmol/L BAEE底物溶液，Sepharose 4B，0.5mol/L NaCl，2mol/L NaOH，0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，56%1，4-⼆氧六环（V/V），环氧氯丙烷（A.R），亲和柱平衡液（0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液（0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液），，⽆⽔氯化钙，亲和柱平衡液新鲜猪胰脏，PH2.5-3.0⼄酸酸化⽔，2.5mol/L H2S04（ 0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液：（0.5mol/L KCl— 0.1mol/LPH2.5甲酸溶液）等。
一、实验目的1. 学习和掌握胰蛋白酶的纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的理化性质和生物学功能。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于胰腺中的丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白质的能力。
本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，该方法具有操作简便、成本低廉、纯度较高等优点。
三、实验材料1. 胰蛋白酶粗品：由动物胰腺提取。
2. 硫酸铵：分析纯。
3. 氯化钠：分析纯。
4. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）：0.1 mol/L。
5. 其他试剂：三氯乙酸、硫酸、氢氧化钠等。
四、实验方法1. 胰蛋白酶粗品预处理：将胰蛋白酶粗品溶解于磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌使其充分溶解。
2. 盐析：向胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵，使其饱和，充分搅拌，室温静置过夜。
3. 沉淀收集：用布氏漏斗抽滤，收集沉淀，并用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。
4. 脱盐：将沉淀溶于适量的水，加入适量的三氯乙酸，使蛋白质变性，去除杂质。
5. 纯化：将变性后的蛋白质溶液透析，去除三氯乙酸和硫酸铵。
6. 蛋白质复性：将透析后的蛋白质溶液加入适量的磷酸盐缓冲液（pH7.0），使蛋白质复性。
7. 检测：采用SDS-PAGE方法检测纯化后的胰蛋白酶。
五、实验结果与分析1. 盐析：在胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵后，溶液出现白色沉淀，说明胰蛋白酶已经盐析。
2. 沉淀收集：通过抽滤，收集到白色沉淀，表明胰蛋白酶已经沉淀。
3. 脱盐：加入三氯乙酸后，沉淀溶解，表明蛋白质已经变性。
4. 纯化：透析后的蛋白质溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，只有一个明显的条带，说明胰蛋白酶已经纯化。
5. 蛋白质复性：复性后的胰蛋白酶溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白条带清晰，说明蛋白质已经复性。
六、实验结论本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，成功地将胰蛋白酶从粗品中分离出来，并通过SDS-PAGE电泳检测，证明纯化后的胰蛋白酶具有较高的纯度。
一、实验目的1. 学习并掌握胰蛋白酶的提取、纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的活性测定方法。
3. 掌握实验室操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于哺乳动物胰脏中的蛋白水解酶，具有高效、专一的特点。
本实验通过从胰脏中提取胰蛋白酶，利用其活性对蛋白质进行水解，从而实现对胰蛋白酶的制备。
三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜猪胰脏、生理盐水、盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、硫酸铜、Folin试剂、酪蛋白、三氯醋酸等。
2. 仪器：研钵、天平、烧杯、试管、移液管、滴定管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
四、实验步骤1. 胰蛋白酶提取（1）将新鲜猪胰脏去脂肪、去筋膜，剪成小块，用生理盐水清洗，去除杂质。
（2）将胰脏放入研钵中，加入适量的生理盐水，研磨成浆状。
（3）将研磨好的胰浆用纱布过滤，收集滤液。
2. 胰蛋白酶纯化（1）将滤液加入适量的盐酸，调节pH值为4.5，静置过夜。
（2）次日，将沉淀物用蒸馏水洗涤，去除杂质。
（3）将洗涤后的沉淀物加入适量的硫酸铵溶液，调节硫酸铵浓度为40%，搅拌，静置2小时。
（4）取沉淀物，用蒸馏水洗涤，去除杂质。
（5）将洗涤后的沉淀物用硫酸铜溶液处理，去除杂质。
3. 胰蛋白酶活性测定（1）取一定量的酶液，加入酪蛋白溶液，在40℃、pH值为7.5的条件下反应30分钟。
（2）加入三氯醋酸终止反应，离心分离。
（3）取上清液，用Folin试剂测定吸光度，计算酶活性。
五、实验结果与分析1. 胰蛋白酶提取通过研磨和过滤，从新鲜猪胰脏中成功提取出胰蛋白酶。
2. 胰蛋白酶纯化通过盐析、洗涤、硫酸铵沉淀和硫酸铜处理，成功纯化出胰蛋白酶。
3. 胰蛋白酶活性测定在最佳条件下，胰蛋白酶对酪蛋白的水解活性较高，说明成功制备出具有活性的胰蛋白酶。
六、实验结论本实验成功从猪胰脏中提取、纯化出具有活性的胰蛋白酶，为后续的实验研究提供了条件。
七、实验注意事项1. 提取过程中，需保持操作环境清洁，避免污染。
生物化学综合性实验的设计与实现——以亲和层析法纯化猪胰蛋白酶为例黄体冉;刘悦萍;张国庆;王文平;张静【期刊名称】《实验室研究与探索》【年(卷),期】2017(036)004【摘要】生物化学实验是生命科学领域一门重要专业基础课,其所包含的实验技术在训练学生基本技能、培养实践能力和创新能力上起着至关重要的作用.围绕生物化学中蛋白质化学、酶学性质的有关内容,将鸡卵粘蛋白的制备、猪胰蛋白酶的制备、猪胰蛋白酶的纯化以及纯胰蛋白酶活性和鸡卵粘蛋白抑制活性的测定重新整合,设计了一个包括蛋白质分离纯化、蛋白质含量测定以及酶活性测定3个单元的综合性实验,并将光谱和色谱技术融入其中.最后对实验内容的综合性设计部分进行了探索性研究,以期为生物化学综合性、设计性实验开发和研究提供参考.【总页数】5页(P179-183)【作者】黄体冉;刘悦萍;张国庆;王文平;张静【作者单位】北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;农业部都市农业(北方)重点实验室,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.亲和层析法纯化小鼠腹水来源的单克隆抗体的实验研究 [J], 徐颖;蒋玉平;马泓冰;胡玉敏;孙中文;张学光2.开设综合性、设计性生物化学实验的探索与实践--以河北北方学院医学检验学院生物化学实验教学改革为例 [J], 张效云;董明纲;宋桂芹;徐志伟;郝敏;辇晓峰;王文栋3.生物化学实验多媒体课件制作初探——亲和层析纯化胰蛋白酶示教片的制作 [J], 赵立青;李小菊4.亲和层析纯化猪胰蛋白酶的研究 [J], 孟国良5.亲和层析法纯化尿胰蛋白酶抑制剂及部分性质研究 [J], 胡加亮;王旻;李谦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪胰抑肽酶的分离和鉴定
方林求
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】1992(000)003
【摘要】猪胰脏除分泌多种用以消化食物蛋白质的蛋白水解酶外,还分泌与蛋白酶共存的酶抑制剂,它们相互制约处于动态平衡,发挥重要的生物调节作用。
近年来报道,一些外源性蛋白酶抑制剂能抑制癌细胞蛋白酶的分泌,遏阻恶性肿瘤的生长,还可用于外科手术,减少手术的输血量等。
本文介绍采用纤维素离子交换层析从猪胰脏分离出胰蛋白酶抑制剂(商品名为抑肽酶)的方法。
一、材料与方法1.材料:新鲜猪胰脏购于市场。
CM-纤维素和DEAE-纤维素为上海试剂四厂产品。
胰蛋白酶,Difco 进口分装。
N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)
【总页数】3页(P31-33)
【作者】方林求
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】TQ464.8
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3.猪胰抑肽酶的部分性质研究 [J], 方林求
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