赛福基因公开课第四节《高通量测序（NGS）数据分析中的质控》
大家好，很高兴今天有机会和大家一起来探讨高通量数据分析中质量控制的相关知识和技术。
这次探讨的内容包括三个方面：高通量测序和数据分析的基本流程，高通量数据分析中的原始数据质控和高通量数据分析中的比对结果质控。
首先， 为什么需要做质量控制呢？ 我们知道，要想有一个好的分析结果，必须要有一个质量好的数据。理想的情况是：高通量测序的结果里只有我们想要的序列,而且每个序列碱基的可信度都是100%。但现实并非如此。比如在建库过程中的各种物理化学原因或污染，测序仪本身的缺陷等，都会造成测序结果里有不利用分析的序列存在，比如碱基的质量过低或者含有其他来源的污染序列。为了后续生信分析的的可靠性，就要把这些不利于分析序列部分或整条清除。那怎样来查看数据质量，怎样处理不理想的数据以得到相对可靠的分析结果呢？首先我们来看看高通量数据分析的基本流程，看看哪些步骤应该做质控。
第一个部分：高通量测序和数据分析的基本流程。
在高通量数据测序和分析的流程中，首先，要从需要测序的组织里提取DNA， 然后将提取的DNA片段化。如果要测全基因组（全基因组测序即WGS）的话，这些片段就可以直接用来扩增和测序。如果只要测外显子区域（全外显子测序即WES）的话，就要利用这些片段和探针对外显子区进行捕获和富集， 然后对捕获的外显子区DNA进行测序。如果这些测序得到的结果里只含有我们需要的序列而且测序仪识别的每个碱基都正确的话，下面所需要做的只是将序列比对到参考基因组，从比对结果里识别DNA变异， 最后对识别到的变异进行功能注释用来寻找致病的变异。但事实上，通过全基因组测序或全外显组测序得到的结果里不只是含有我们需要的序列，而且碱基的可信度也不是100%。 所以，为了得到可靠的生信分析结果，我们就必须做质控（quality control）。如右边的示意图所示，质控包括拿到数据之后对原始数据的质控和比对到参考序列以后对原始比对结果的质控。今天我们重点来探讨这两步质量控制的知识和技术。
干货第五期课程回顾如何利用NGS技术做遗传病基因组分析与研究
CNGBdb组学/数据库系列课程开讲啦!
2019年8月8日上线
课程名称：如何利用NGS技术做遗传病基因组分析与研究
讲师：方明艳/深圳华大生命科学研究院资深信息分析工程师，华大基因学院高级讲师，瑞典卡罗林斯卡医学院医学科学博士
课程现场
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课程概要
1. 高通量测序实验、分析流程简介
2. 候选基因分析思路
3. 遗传病案例分析
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现场Q&A
Q：转录组水平检测突变是否可靠？
A：转录组水平的流程和基因组水平类似，也是variants calling
（获得vcf文件），然后看突变数据的具体信息。比如说突变的质量信息及reads的支持情况；
如何结合基因组水平和转录组水平分析，以遗传病为例，可以根据基因组突变的具体情况去判断，如果这个基因突变是loss-of-function，可以去转录水平找表达的表达情况，如果表达量有显著降低，也就反应了基因的功能。
Q：请问RAPID是什么？
A：这是一个日本科学家建立的原发性免疫缺陷病的数据库，在2012年之后就没有更新，之前都是手动收集和致病相关的突变信息，所以这个数据库质量比较高，但是因为后续没有更新，所以其数据量始终维持在6000个左右。
补充信息：/rapid_original/
Q：没有检测到变异的区域是否也可能是很重要的区域？
A：首先看参考基因组区域是否是N，如果不是N的话，需要判断这个区域的特征，比如是否存在重复序列或GC含量异常，举例的数据是基于WES的分析结果，如果通过以上判断，捕获环节也没有问题，或基于WGS的分析时，这个就是重要的区域，即完全没有变异但是被检测到。
Q：基于染色体区域变异情况，这个是从哪里可以看到呢？
A：这个是需要统计的数据，一般这个不是常规分析过程中改的，不过做生物信息分析时，比对文件中有一个bam_stat文件(bwa比对)，或者用Soap比对也有一个SOUP_stat文件，这些文件可以看出具体基因每一个外显子coverage的情况，还有探针的覆盖情况以及实际的覆盖情况，然后根据这些数据就可以做出这个图（PPT：21）。
NGS系列讲座——NGS基本原理
NGS（Next-Generation Sequencing）是一种高通量的DNA测序技术，也是现代生物学研究中重要的工具之一、NGS的出现极大地推动了基因组学、转录组学、蛋白质组学等领域的研究进展。本文将重点介绍NGS的基本原理，并对相关技术进行简要的说明。
NGS技术的基本原理可以简单概括为将待测DNA大分子序列分割成小片段，然后通过并行进行大规模的测序，并最后将这些小片段的测序结果进行拼接，以获取原始DNA序列。具体的步骤包括DNA样本的制备与库构建、DNA片段的文库构建、测序、数据处理与分析等。
首先，NGS技术需要将待测DNA样本进行处理和制备，一般包括DNA的提取、纯化和断裂。断裂后的DNA片段可以通过两种不同的方式进行文库构建。一种是通过PCR（聚合酶链式反应）扩增的方式构建文库，该方法适用于高测序深度的应用，例如全基因组测序。另一种方式是利用适应性文库构建方法，如特定酶切、连接适配体、聚合酶链式反应等。这种方法适用于低测序深度的应用，例如RNA-seq、甲基化测序等。
接下来，构建好的文库会经过芯片装片和测序前处理，测序前处理一般包括DNA片段的扩增、芯片上的密集排列和相应的预处理过程。然后，测序过程会根据所使用的技术进行不同的处理。目前常见的测序技术包括Illumina/Solexa、Roche/454和Ion Torrent等。Illumina/Solexa技术是目前最主流的NGS测序技术之一，它基于测序-by-synthesis的原理，通过使用碱基特异性荧光标记的核苷酸来产生荧光信号，并将每个碱基对应的信号进行记录。Roche/454技术则是通过测量平均每个附着到DNA链末端的分光光度单位的发光来实现测序。Ion Torrent则是利用质子发生器件测量质子释放来实现测序。 最后，测序得到的数据会通过各种算法进行处理与分析。一般包括数据质量控制、序列比对、变异检测等步骤。该过程涉及大量的数据处理和计算，需要借助高性能计算机和专业的数据处理软件来进行。
NGS检测及其应用
NGS 检测：高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing
technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
Ngs检测
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation" sequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。更多内容可关注盛景基因。
Ngs基因检测
高通量测序经过近十年来的迅猛发展，已经深入到生命科学的各个领域，不仅有力地推动了基础研究的发展，也在逐渐征服临床应用。
与Sanger法为代表的传统测序法相比，高通量测序技术在处理大规模样品时具有显著的优势，又快(两天)又多(数百万克隆)，成为目前组学研究的主要技术。
当前主要的测序技术平台
1、solexa测序技术(即大家耳熟能详的illumina测序平台);
2、454测序技术(读长长，但是准确度较低，成本较高，即焦磷酸测序技术，少量市场占有);
3、solid测序技术(双色编码技术，目前基本在市场上见不到了)
Ngs基因检测分类
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：
大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing,
MPSS)、
聚合酶克隆(Polony Sequencing)、
454焦磷酸测序(454 pyrosequencing)、
Illumina (Solexa) sequencing、 ABI SOLiD sequencing、
离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、
DNA 纳米球测序 (DNA nanoball sequencing)等。
