黄芪ISSR-PCR反应体系的建立及优化

中国兰ISSR—PCR反应体系优化及引物筛选作者：黄晓慧巫伟峰陈春张毅智汪长水徐建球陈发兴陈孝丑来源：《南方农业学报》2018年第07期摘要：【目的】优化中国兰的ISSR-PCR反应体系，并筛选适用于中国兰ISSR分析的候选引物，为ISSR分子标记在中国兰的辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等提供技术参考。

【方法】以6个中国兰品种为材料，采集其叶片样品，分别用研钵法和研磨仪法进行破碎研磨，比较两种方法提取DNA的效果，利用L25（53）正交试验和单因素试验对DNA模板量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、循环数和退火温度进行优化，建立最佳ISSR-PCR 反应体系，并从ISSR分子标记通用引物中筛选适用于中国兰的ISSR分析候选引物。

【结果】研磨仪法提取的DNA浓度明显高于研钵研磨法，但二者提取的DNA质量均较好（OD260/OD280为1.7～2.0）。

对ISSR-PCR反应体系扩增结果的影响程度排序为DNA模板量>引物浓度>2×Taq Master Mix添加量。

综合考虑成本和DNA模板量，最佳ISSR-PCR反应体系（20.0 μL）：DNA模板10.0 ng、引物0.8 μmol/L和2×Taq Master Mix 9.0 μL。

最佳循环数为35，最佳退火温度为49.6 ℃。

基于上述优化结果，从100条引物中共筛选出42条适用于中国兰的ISSR候选引物。

【结论】研磨仪法可有效提高中国兰基因组DNA的提取率和质量，且利用优化后的ISSR-PCR反应体系和扩增程序及筛选出的引物，扩增获得的条带清晰、稳定，多样性好，可用于中国兰的遗传多样性和亲缘关系等分析研究。

关键词：中国兰；ISSR；分子标记；反应；引物筛选中图分类号： S682.310.36 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1282-070 引言【研究意义】中国兰又称国兰，是中国传统兰花的统称，为兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）植物，其味幽香，花色淡雅，素有花中君子和天下第一香之美称，且具有独特的内涵和意境，观赏和经济价值很高（陈心启，2011）。

珍稀濒危植物宝华玉兰ISSR—PCR反应体系建立及优化摘要：为建立和优化宝华玉兰（Magnolia zenii Cheng）ISSR-PCR反应体系，采用正交试验和单因子试验方法对影响PCR 扩增体系中的Mg2+、dNTPs、DNA模板、引物和Taq聚合酶一定浓度的用量5个因子进行分析比较。

结果显示，宝华玉兰ISSR-PCR 25 μL反应体系中的5个因子最佳水平分别为DNA模板（20 ng/μL） 3.5 μL，引物（10 μmol /L） 1.25 μL，Taq聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，Mg2+（25 mmol/L） 2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 0.8 μL。

宝华玉兰ISSR-PCR反应的最优体系建立，为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。

关键词：宝华玉兰（Magnolia zenii Cheng）；ISSR-PCR反应体系；种质资源保护中图分类号：Q949.747.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）16-4206-04DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.16.034宝华玉兰（Magnolia zenii Cheng）是木兰科（Magnoliaceae）珍贵园林观赏植物，在每年的3～4月开花，其芳香艳丽、姿态优美，有极高的观赏价值。

但其仅产自江苏省句容县宝华山，数量较少，已被列为国家二级重点保护植物。

由于宝华玉兰产地单一，对于环境的要求特别严格，所以人工栽培并成功的事例很少，同时由于林下灌木层不断被破坏，没有更新苗木，现已处于濒危状态[1]。

面对如此严峻的形势，开展对宝华玉兰的遗传多样性分析研究、制定具有针对性的种质资源保护策略刻不容缓。

简单序列重复区间扩增多态性（Inter-simple sequence repeats，ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年创建的一种分子标记技术[2]，ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与其他技术相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低，且多态性更丰富；并且重复性高、稳定性好，同时具备简便、易操作等特点；相比之下，ISSR 更快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高[3]。

建兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化王朝雯; 孙小琴; 杨柏云【期刊名称】《《农业科学与技术（英文版）》》【年(卷),期】2010(011)003【摘要】[目的]研究建兰[Cymbidium ensifolium(Linn.) Sw]总基因组DNA的提取方法,并对建兰ISSR-PCR反应体系进行优化,建立更为完善的反应体系。

[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量;用分光光度计测定其纯度和浓度,DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算,浓度估算法为:DNA浓度(ng/μl) =OD260×50×稀释倍数。

计算DNA获得率(DNA量/所用叶片量×100%)。

对建兰ISSR-PCR反应的4项影响因素(DNA模板、TaqDNA聚合酶、Mg2 +和dNTPs)逐个作5水平进行研究,以筛选最优的建兰ISSR-PCR反应体系。

[结果]获得高质量的建兰基因组DNA,以及优化了的建兰ISSR-PCR反应体系,即25μl PCR反应体积中,2.5μl 10×PCR buffer,2.5mmol/LMgCl2,240 ng模板DNA,160μmol/LdNTPs,1.25 UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,双蒸水15.78μl。

最佳扩增程序为:94℃预变性5min,然后进行40个循环:94℃变性30 s,50 ～60℃退火(退火温度随引物不同而定) 30 s,72℃延伸50 s,72℃延伸7 min。

[结论]建立了建兰ISSR-PCR反应体系最适合的条件,为进一步利用ISSR分子标记技术进行建兰遗传多样性研究提供了基础。

【总页数】4页(P37-40)【作者】王朝雯; 孙小琴; 杨柏云【作者单位】南昌大学生命科学与食品工程学院江西南昌 330031【正文语种】中文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

《基于ISSR和SCoT分子标记的蒙古黄芪遗传多样性分析》篇一一、引言遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，对植物种质资源的保护和利用具有重要意义。

蒙古黄芪作为一种重要的中药材，其遗传多样性的研究对于了解其种质资源、遗传特性和种群结构等方面具有重要作用。

近年来，随着分子生物学技术的发展，ISSR（简单重复序列PCR）和SCoT（Sequence Characterized Amplified Region）等分子标记技术被广泛应用于植物遗传多样性的研究中。

本文旨在利用ISSR和SCoT分子标记技术对蒙古黄芪的遗传多样性进行分析，为蒙古黄芪的种质资源保护和利用提供科学依据。

二、材料与方法1. 材料本研究所用材料为不同地区、不同种源的蒙古黄芪样品，共收集了XX个样地的XX个样品。

2. 方法（1）DNA提取采用CTAB法提取蒙古黄芪基因组DNA，并进行纯化和浓度检测。

（2）ISSR和SCoT扩增利用ISSR和SCoT引物对提取的DNA进行扩增，观察并记录扩增结果。

（3）数据分析对扩增结果进行统计和分析，计算遗传多样性指数、遗传相似性系数等指标，并绘制遗传聚类图。

三、结果与分析1. ISSR和SCoT扩增结果通过ISSR和SCoT扩增，得到了清晰、可重复的指纹图谱。

各样品间的多态性位点丰富，表明蒙古黄芪具有较高的遗传多样性。

2. 遗传多样性分析（1）遗传多样性指数根据扩增结果，计算了蒙古黄芪的遗传多样性指数。

结果显示，蒙古黄芪的遗传多样性较高，各样品间的遗传距离较大。

（2）遗传相似性系数通过计算遗传相似性系数，分析了各样品间的亲缘关系。

结果显示，不同地区、不同种源的蒙古黄芪样品间存在一定的遗传差异，但也有一定的遗传共性。

（3）遗传聚类图根据遗传相似性系数，绘制了遗传聚类图。

结果显示，蒙古黄芪的种质资源可以划分为几个不同的遗传群，反映了其种群结构和地理分布特点。

四、讨论本研究利用ISSR和SCoT分子标记技术对蒙古黄芪的遗传多样性进行了分析，得到了清晰、可靠的指纹图谱和遗传参数。

均匀设计优化建兰ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系摘要：采用均匀设计，对影响建兰ISSR—PCR体系的引物、Mg2+、dNTP 和Taq DNA聚合酶浓度等进行4因素5水平和4因素3水平两轮优化，建立了适合于建兰ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中，含引物0.25tLmol/L、Mg2+2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA 40ng.在此基础上对扩增程序中的循环次数和退火温度，以及ISSR引物进行筛选，筛选获得的扩增程序为：94℃预变性5min；接着进行32个循环：94℃变性35s，52－56℃退火45s，72℃延伸90s；循环结束后，72℃延伸10min.同时筛选得到14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。

关键词：建兰；ISSR—PCR；均匀设计建兰(Cymbidium ensifolium(Linn.)Sw.)为兰科(Drchidaceae)兰属(Cymbidium)植物，极具观赏和经济价值，兰科植物广泛分布于各种生态环境，表现有高度特异的形态、结构和生理特性，建兰也不例外，长期的自然杂交以及人工选育，品种间存在很高的遗传分化和种间类型，这为杂交育种选配亲本提供了丰富的种质资源；但同时，仅凭花色、花型、叶色、叶型、花梗等传统的形态指标来辩识品种，则存在很大难度，这不仅给品种的整理和研究带来困难，同时也影响新品种的注册登录和产权保护。

以DNA指纹图谱为指标的分子标记技术，标记的位点数远大于形态标记和生化标记，且不易受环境因素的影响，可弥补或解决形态标记和生化标记中的缺陷或难题，因此，被广泛用于植物品种的鉴定，ISSR(inter-simple sequence repeat，简单序列重复区间)是Zietkiewicz等在SSR(simplesequence repeat，简单序列重复)基础上创建的，基于PCR技术的一种新型分子标记，其基本原理是利用真核生物基因组中广泛存在的SSR来设计引物，而无需预先克隆和测序，用于ISSR-PCR 扩增的引物通常为16－18个碱基序列，其主体是2－4个碱基组成的串联重复序列，然后在其5′端或3’端加上1－4个锚定碱基，引起特定位点退火，使引物与相匹配的SSR的一端结合，从而保证ISSR引物能够对SSR之间的DNA序列进行PCR扩增，ISSR分子标记操作简单，可揭示的多态性较RAPD和RFLP、SSR高，重复性较RAPD好。

川续断issr反应体系的建立与优化
近来，细胞分子生物学中非常重要的一个研究方向之一是进化基因组学。

Issr (Inter Simple Sequence Repeat) 反应可以提供一种简单而强大的方式来进行进化基因组学研究，在许多研究中Issr反应被广泛用于识别物种边界，系统发育和遗传多样性等。

Issr反应是一个快速、灵敏的技术，可以用来检测植物材料中的内源性互补序列重复（SSCR），其特异性检测可以识别物种，并可以用来抵御环境挑战和重要生物性状的变异。

Issr反应体系由两个步骤组成，第一步是特性模板探针的检测，第二步则是对克隆片段进行PCR 扩增，以收集特异性信号。

因此，续断Issr反应体系的建立和优化成为当前研究的重要课题，以提高Issr反应的准确性和灵敏度。

首先，克隆的特异性片段需要通过特定的模板接头DNA来获得更高的灵敏度。

此外，一些特殊的反应体系也可以大大提升Issr反应的特异性，比如Y-Taq等。

最后，PCR产物可以经过适当的内切酶以及适当的混合条件来控制，从而尽可能减少无特异性反应产物的产生，提高Issr反应的灵敏度。

综上所述，续断Issr的反应体系的建立和优化是一项复杂的任务，但可以显著提高反应的准确性和灵敏度，从而为进化基因组学的研究提供更多的迅速而可靠的结果。