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腈水合酶催化反应条件的研究刘舒;沈旭丰;孙先锋【摘要】Taking the enzyme of free cell as the catalyst, the effects of dilution factor, concentration of acrylonitrile, temperature, pH value, concentration of cells and concentration of acrylmide on the activity of nitrile hydratase were studied. The result shows that the temperature, the concentration of acrylonitrile and the concentration of gcrylamide are the most important among these factors. The activity of nitrile hydratase is 4 901U/mL(broth) at the reaction temperature 28℃ t he concentration of acrylonitrile is 40g/L;the activity of nitrile hydratase in the solution of 40% acrylamide is just 40% of that in solution of 5% acrylamide. It is found that the activation energy of the nitrile hydratase is 40. 291kJ · mot1 through the research at the different reaction temperature.%以自由细胞的酶作为催化剂,研究了菌体稀释倍数、丙烯腈浓度、温度、pH值、菌悬液用量和丙烯酰胺浓度对腈水合酶活性的影响,结果表明,温度、丙烯腈浓度和丙烯酰胺浓度是影响酶活性的主要因素.反应温度在28℃时酶活性达到最大为4091U/mL菌液,丙烯腈浓度采用40g/L.当反应体系中丙烯酰胺浓度为40％时,其酶活只有丙烯酰胺浓度为5％时酶活的39.2％.对不同反应温度下酶活的研究,得出腈水合酶催化反应的活化能为40.291kJ · mol-1.【期刊名称】《纺织高校基础科学学报》【年(卷),期】2012(025)001【总页数】6页(P83-87,106)【关键词】丙烯酰胺;腈水合酶;丙烯腈;催化反应【作者】刘舒;沈旭丰;孙先锋【作者单位】西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048【正文语种】中文【中图分类】Q559在微生物转化生产丙烯酰胺的过程中，酶催化反应是关键环节，因此研究酶催化反应的条件成为必然．腈水合酶（Nitrile hydratase，EC4．2．1．84）是以硫原子和半胱氨酸－亚磺酸残基（Cysl12）为绝对中心的一类可催化腈水解的酶．随着科研人员对腈水合酶结构、催化机理、生物合成调节以及酶学性质的深入研究，腈水合酶已被成功应用于工业生产丙烯酰胺上．最早提出用微生物法生产酰胺的是法国研究者Galzy及其研究组，他们发现了一种能催化腈水解的微生物Brevbacteriu m R312，可催化合成丙烯酰胺（A M），但是酶活很低［1］．1982年，京都大学山田秀明研究组发现了Pseudomonas Chlor aphis B32，经过驯化其酶活达到1 260个单位［2］．1988年，山田秀明等发现了一种性能更好的腈水合酶产生菌Rhodococcus r hodococcus J1，其酶活达到了1 630个单位，一度成为日本酰胺生产的工程菌．高活力菌种的成功应用，使日本日东公司年产量从最初的0．4万t／a迅速提升至3万t／a［3］．采用酶生物催化剂代替化学催化剂已成为绿色化学发展的方向之一［4］．与化学法相比，微生物法制备丙烯酰胺具有反应在常温常压下进行、选择性高、活性高、能耗低、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点［5］．目前，国内用生物法生产丙烯酰胺多采用海藻酸盐包埋法固定化细胞的工艺，而该工艺本身存在通透性差、固定化细胞强度小以及引入离子等问题，另外在固定化阶段会损失相当一部分酶活．正由于酶活的损失，一批固定化的细胞往往水合反应3批左右就需要更新［6］．利用自有细胞直接进行水合反应并实现连续化生产能较好地解决以上问题．本文对诺卡氏菌Nocar dia sp．ZT－2自由细胞的腈水合酶反应条件进行了研究，以期优化酶反应条件，提高酶活性．1 实验1．1 原料丙烯腈（上海三浦化工有限公司，分子量53．06，化学纯）、丙烯酰胺（北京化学试剂公司，分子量71．08，分析纯）．1．2 实验菌株诺卡氏菌Nocar dia sp．ZT－2（从咸阳第二印染厂污水处理厂的活性污泥中筛选，由西安工程大学生物工程实验室保藏并鉴定．）1．3 培养基1．3．1 斜面培养基（g／L）牛肉膏5，蛋白胨1，Na Cl 5，琼脂4，p H 7．2．1．3．2 发酵培养基（g／L）葡萄糖20，酵母膏5，尿素6，味精（谷氨酸钠）1，KH 2 PO4 0．5，K 2 HPO4 0．5，M gSO4·7 H 2 O 0．5，Co Cl2·6 H 2 O 0．08 mmol／L，吐温80 1，p H 7．2．1．4 自由细胞的培养方法将菌株从斜面接种于250 mL发酵摇瓶中，装液量为25 mL发酵培养基，在28℃下培养96h，摇床转速为180r／min．1．5 生物量的测定将发酵液稀释一定倍数后，在460n m波长下测量吸光度值．根据测定的菌体干重和吸光度标准曲线，一个OD值相当于每L发酵液有0．45g干菌重量．1．6 操作过程1．6．1 菌悬液的制备取一定量的发酵液，在6 500r／min条件下离心8 min，弃上层清液，用p H＝7．0的磷酸缓冲液洗涤菌体．在同样条件下重复离心分离和洗涤两次，制成与原发酵液菌体浓度相等的菌悬液，冰箱保存备用．1．6．2 催化水合反应取19 mL 50 mmo L p H为7的磷酸缓冲溶液和1 mL纯丙烯腈，放入250 mL具有磨口玻璃塞的三角瓶中，恒温至28℃．取一定量的菌悬液根据具体实验要求稀释适当数倍，取1 mL于三角瓶中，准确反应5 min，然后加入1 mL 4 mol／L的盐酸终止反应［7］．1．7 酶活测定方法除在丙烯酰胺浓度对产物影响中丙烯酰胺生成量用液相色谱测定外，其余丙烯酰胺生成量及所有酶活的测定采用KBr O3－KBr法．液相色谱操作条件如下：流动相为甲醇∶水＝15∶85，流速1 mL／min，温度25℃，检测波长205n m．产物计算方法为：采用外标法以峰面积为标准配置各种浓度梯度的丙烯酰胺标准样品，拟合出丙烯酰胺标准校正曲线．KBr O3－KBr 法测定丙烯酰胺生成量及酶活：丙烯酰胺的生成量（mg）＝0．5×71．0×C（V 0－V）×V 2／V 1，酶活＝C（V 0－V）×（1／2）×V 2／V 1×1 000／t．C为Na2 S2 O3 溶液的摩尔浓度，mol／L；V 0 为空白消耗Na2S2 O3溶液的体积，mL；V为滴定样品消耗Na2S2 O3溶液的体积，mL；1／2为反应所生成Br 2与Na2 S2 O3溶液的化学计量比；V 1为反应所取上清液的体积，mL；V 2为上清液总体积，mL；1 000为mmol转换成μmol；t为反应时间，min；0．5为生成丙烯酰胺的摩尔数；71．0为丙烯酰胺的分子量．2 结果与讨论表1 菌液稀释倍数与酶活稀释倍数4 8 12 16 20 30 40酶活／U·mL－1 2 853 2974 2 910 2 737 2 658 2 808 2 5302．1 稀释倍数对酶活的影响因为培养所获得的菌液酶活都比较高，而在后面的研究中，为了更好地反映各种因素对催化反应的影响，是不期望反应过快的，所以需要对菌液进行稀释．因此，分别将菌液稀释4，8，12，16，20，30，40倍，水合反应后分别测量此时的酶活，然后将测得的酶活乘以稀释倍数，换算得到原始的酶活．换算后结果如表1所示．以稀释16倍的酶活为1，求出不同稀释倍数下的相对酶活U，然后作图，结果如图1所示．从图1可以看到，菌液经稀释后，对折算的原始酶活，在稀释4～12倍之间，酶活相对偏高但在1．1以内；而在16～30倍之间折算的酶活相对偏差较小，误差保持在±10%以内．可以认为，在研究的范围内，稀释倍数对于酶活可以用折算的办法来补偿．2．2 丙烯腈浓度对酶活的影响在催化水合反应中，丙烯腈是一种底物，其浓度对酶活可产生两种影响．一方面，由于底物与中间络合物（ES）生成的三元复合物（SES）不可分解成产物，且具有生理毒性，浓度过高对菌体有害，会造成酶活的快速下降；另一方面，从反应动力学的角度来讲，底物浓度的提高又有利于提高反应速率［8－10］．恰是这两种影响正好相反，所以研究丙烯腈浓度对酶活的影响十分必要．在总体积为25 mL，反应温度为28℃，p H 为7．0情况下，分别考察丙烯腈浓度为10g／L，20g／L，30g／L，40g／L，50g／L，60g／L，80g／L，100g／L，120g／L，140g／L，160 g／L时对水合反应体系中反应速率的影响，结果如图2所示．图1 稀释倍数对酶活的影响图2 丙烯腈浓度对酶活的影响如图2所示，当丙烯腈浓度小于40g／L时，酶活随浓度的增加而快速上升；而在丙烯腈浓度40g／L至120g／L之间，随着浓度的增加，其酶活增加比较平缓，并且在丙烯腈浓度120g／L时，酶活达到最大，为4 125 U／mL，然后酶活随丙烯腈浓度的增加而缓慢降低．可以看出，在丙烯腈浓度大于60g／L以后，酶活还能随着浓度的增加而上升，但是上升幅度比较小，说明高浓度底物已开始对酶活产生抑制作用了．本实验中，丙烯腈浓度最大为160g／L，但此时还观察不到对酶活明显的抑制作用．这说明在本研究的范围内，菌株ZT－2所产的酶对底物的耐受性是比较强的．在后续的实验中，采用丙烯腈浓度为40g／L，虽然丙烯腈浓度在120g／L时所产酶活最高，但相比40g／L时的酶活仅提高了31%，而底物用量却是前者的3倍之多，也就是说丙烯腈转化率降低了．可见采用高的底物浓度并不是最佳选择．根据丙烯腈浓度与酶活的关系，可求得腈水合酶催化反应的米氏常数．求得的米氏常数K m＝14．048g／L，表示的是反应速率达到最大速率一半时的底物浓度．2．3 温度对酶活的影响由图3可见，从18℃到28℃之间，酶活随着反应温度的升高而加快，在28℃时达到最大，测定的酶活为4 091 U／mL菌液；而当反应温度大于30℃后，酶活下降非常快，到40℃时酶活只有28℃时的44．83%，不及其一半，表观酶活仅为1 834 U／mL菌液．分析其原因，可能是酶在高温下失活所造成的．由阿累尼乌斯公式可知，反应速率常数k的对数应该与1／T成正比，反应速率常数k与表观酶活r 成正比．因而，在低于301 K时，以ln（r／U·mol－1）对1／T 作图，可得到一条直线，如图4．直线拟合结果由此可以算出反应的活化能为E a＝40．291kJ·mol－1．2．4 p H对酶活的影响目前从文献报道来看，水合反应大都在中性环境下进行，在此环境下反应速率达到最大值，多数研究者得到的结果也多在7～7．5之间达到最大反应速率［13－14］．为此，本实验在总体积为25 mL，反应温度为28℃，丙烯腈浓度为40g／L的情况下考察了p H 为5，6，6．5，7．0，7．5，8．0，9．0时对酶活的影响情况．结果如图5所示．由图5可知，p H在低于6．5时，酶活随p H的升高而逐渐增大，而在6．5～7．0时，酶活快速上升；当体系p H超过7．5时酶活迅速下降，在7．0～7．5这个区间内酶活维持在较高水平，说明反应体系的p H处在中性范围有利于酶的高效表达，从而获得较高的酶活．因此在以后的研究中水合反应体系的p H为7．3．图3 温度对酶活的影响图4 温度与酶活的线性拟合注：粗线为拟合曲线，细线为数据点连线．2．5 菌悬液用量对反应速率酶活的影响酶作为生物催化剂，其催化反应的速度直接取决于酶浓度［15］．本实验考察在总体积为25 mL，反应温度为28℃，丙烯腈浓度为40g／L，p H为7．3的情况下菌体加入量对酶活影响．实验中发现当菌悬液加入量大于20 mL时，酶活开始下降，估计是受到底物限制的原因．所以只研究了菌悬液加入量为2 mL，5 mL，8 mL，11 mL，14 mL，17 mL，20 mL时对产酶的影响．图5 p H对腈水合酶活性的影响图6 菌悬液用量对反应速率的影响由图6可知，酶活随着菌悬液用量的增加而逐渐增大，在菌悬液加入量为20 mL 时，酶活达到了最高值．这符合酶促反应动力学的基本原理，也就是当底物过量时，酶活随着菌液量的增加而增大，当底物浓度限制时，酶活有最大值．当菌悬液加入量V cell大于20 mL时，酶活开始减少．当V cell＝20 mL时，其最大酶活达5 308 U／mL．以菌悬液V cell加入量对酶活作图，并进行拟合，得到直线方程通过拟合方程可以知道一定体积下菌体加入量的酶活，因而在实际生产中，在保证后期分离及生产成本的前提下，采用合理的菌悬液用量可以保持相对较高的酶活性．2．6 丙烯酰胺浓度对产物的影响产物丙烯酰胺（A M）是一种高毒性的物质，对细胞有较大的生理毒性，能够破坏酶的三维结构并在产物释放前与酶形成中间产物EP的复合物，从而使酶不能与底物接触，降低了酶与底物接触的机会，抑制了酶的活性，也就降低了整个反应的速率［16－17］．在不同丙烯酰胺浓度的水合反应体系中得到丙烯酰胺浓度结果如表2所示．表2 丙烯酰胺浓度对酶活的影响反应前A M浓度／*************反应后AM浓度／% 2．04 6．94 11．73 16．65 21．42 31．18 40．76由表2可知，丙烯酰胺作为反应的产物，其浓度的增加能够极大地抑制酶的活性．当其在体系中的浓度低于20%时，对酶活的影响并不是特别明显，若以添加丙烯酰胺为5%的体系作为标准，其相对酶活都在70%以上．而当其浓度大于30%时，酶活急剧下降，到浓度为40%时，相对酶活已不足40%，说明丙烯酰胺浓度的增加能够极大地抑制体系的酶活，降低反应速率．因此，在实际生产中，及时分离出反应体系中生成的丙烯酰胺是非常必需的，也是目前亟待解决的问题．3 结论底物和产物浓度、催化反应温度、反应p H、菌悬液加入量是影响丙烯腈水合酶活性的主要因素，其中反应温度、底物和产物浓度是影响酶活的关键性因素．对于温度的选择，需要从两个影响方面权衡优化得出，一是温度升高有利于获得较高酶活，二是较高的温度会使酶失活．对于底物浓度，也应从两方面加以考虑，一方面底物浓度的增加有利于反应速率的提高，另一方面底物浓度的增加会抑制酶活性．产物浓度在水合反应中应保持在较低浓度范围，其在体系中的浓度低于20%，相对酶活能保持在70%以上，但是当体系中丙烯酰胺浓度大于20%时，酶活下降非常迅速．本文所得到的对酶活影响的参数，对工业用微生物法生产丙烯酰胺的操作条件优化提供了依据．【相关文献】［1］ OHTSUKA Y，HASGA WA J，NAKATSUJI H et a1．Density functional st udy on geo metry and electronic str ucture of nitrile hydratase active site model［J］．J Inter Quan Chem，2002，90（3）：1 174－1 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腈水合酶的实际应用腈水合酶是一种生物催化剂，具有在温和条件下将腈转化为酰胺的能力。
由于其广泛的应用前景，腈水合酶已成为化学、生物工程和制药领域的研究热点。
以下将详细介绍腈水合酶的实际应用。
一、手性合成手性化合物在许多生物活性和药物中具有重要作用，然而，其合成方法往往涉及复杂的化学反应和分离过程。
腈水合酶可以用于手性酰胺的合成，其中，手性碳原子的构型可以在水合反应中得到保留。
通过使用具有对映选择性的腈水合酶，可以以高光学纯度合成手性酰胺。
这种手性合成方法在制药和化工行业中具有广泛的应用前景。
二、治理环境污染腈水合酶可以用于处理腈类化合物的环境污染。
腈类化合物是一种常见的工业废水成分，它们对环境和生态系统具有潜在的危害。
腈水合酶可以高效地将腈类化合物转化为无害的酰胺，从而降低其对环境的影响。
通过生物工程手段构建具有高效腈水合酶表达的微生物或植物，可以实现对腈类化合物的生物治理。
三、合成高分子材料腈水合酶可以用于合成高分子材料。
通过将腈基引入高分子链中，可以改善高分子的性能和功能。
例如，通过使用腈水合酶合成含有酰胺基团的高分子材料，可以获得具有优异力学性能、热稳定性和化学稳定性的新型高分子材料。
这种合成方法具有高效、环保和可持续性的优点，因此在材料科学和化工行业中具有广泛的应用前景。
四、生产药物和中间体腈水合酶可以用于生产药物和中间体。
许多药物和中间体中含有酰胺基团，而腈水合酶可以高效地将腈类化合物转化为酰胺。
例如，一些抗癌药物、抗生素、心血管药物和神经系统药物的生产过程中涉及腈水合酶的反应。
通过使用生物工程手段提高腈水合酶的产量和活性，可以降低药物的生产成本，提高药物的疗效和安全性。
五、优化有机合成路线腈水合酶可以优化有机合成路线。
在有机合成中，有些反应需要在高温、高压或使用有害催化剂的条件下进行，这不仅消耗能源，还会产生废弃物。
通过使用腈水合酶作为生物催化剂，可以在温和的条件下将腈类化合物转化为酰胺，从而优化有机合成路线。
腈水解酶催化腈水解的研究进展刘颖，苏昕*1（沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，沈阳 110016）摘要:腈水解酶催化具有毒性、致畸性、致癌性的腈水解合成羧酸因其反应条件温和、成本低、环境污染少及高选择性（立体、化学、区域）而备受学者和企业家的青睐，产物羧酸广泛用于精细化工、医药中间体、维生素前体等，具有高增值价值，因此腈水解酶具有良好的工业应用前景和巨大的经济价值。
目前对腈水解酶的来源、作用机制、筛选途径、酶结构、催化特性以及腈水解酶基因克隆、纯化、固定化、修饰等研究均有报道。
参考20余篇文献，本文综述腈水解酶催化腈类化合物水解的研究进展。
关键词：腈水解酶，腈化合物，生物催化Advances in nitrilase hydrolyzing nitrilesLIU Ying, SU Xin*(School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China) Abstract: The nitrilases attract substantial attention from scholars and entrepreneurs because of their mild reaction conditions, low-cost, small environmental pollution and high selectivity (stereo-, chemical-, regional-) when hydrolyzing toxic, mutagenic and carcinogenic nitriles. The production of carboxylic acid with high added value is widely used in fine chemicals, pharmaceutical intermediates and vitamin premises. Therefore, the nitrilase has good application prospect and the great economic value. Articles about the sources of enzyme, mechanism, screening approach, structure, catalytic properties, nitrilase gene cloning, purification of nitrilase, immobilization, modification etc have been reported. Based on more than 20 domestic and foreign literatures, recent progress on nitrilases hydrolyzing nitriles was reviewed.Keywords: Nitrilase, Nitriles, Biocatalysis腈是一类含−CN基团的有机物，是合成酰胺、羧酸、酯等的起始原料。
消息热点(NEWS ANDHIGHLIGHTS)腈水合酶制备关键技术研究腈水合酶是一类可以催化腈类物质转化相应的酰胺类化合物的金属酶，工业上利用其催化丙烯腈转 化为丙烯酰胺。
该生物法制备丙烯酰胺工艺在1985年被开发，是生物法替代化学法的典型案例。
随着丙烯酰胺的需求不断扩大，国内外研究机构及学者对腈水合酶产生菌的分离选育、菌株特性研 究、酶的形成条件、酶的结构和性质、生物合成机制、翻译后的成熟机制等进行了深入研究。
如中国专利 CN201710456875.6公开了 一种改造腈水合酶及其应用，该发明改造腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受 性都有显著提升，并且没有导致腈水合酶活性的降低。
改造腈水合酶可催化获得高浓度丙烯酰胺产物，且 可以多批次回用。
CN201610035437.8为一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法，该方法包括以下步骤：（1 &向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己坑中加入表面活性剂span-80,混合均匀 作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；（2)将上步得到的粗乳液在5~30 k P a的跨膜压力下通过 SPG膜乳化器，待粗乳液完全通过SPG膜后，即得到W/0型（油包水）乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戌 二醛，交联0.5~4 h，离心洗涤，即可得到球形腈水合酶粒子。
该发明的制备工艺简单，条件温和，酶活回收 率在50%以上。
重复使用10次后，酶活还可达到初始酶活的45%左右。
同游离酶相比，储藏稳定性也更好。
CN201510244547.0公开了一种高效表达高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其应用，该发明所述的高分 子量型腈水合酶基因nhhB(rbs)A(rbs)<是基于R.rhodochrous J1来源的腈水合酶基因bag，经密码子优化及 表达元件改造之后化学合成得到，该基因全长1 645 bp，编码533个氨基酸，能够在大肠杆菌中成功表达。
腈水合酶研究进展摘要从腈水合酶的结构、分布、酶学性质及其基因克隆和生产中的利用形式等方面简要阐述了腈水合酶的研究进展。
关键词腈水合酶；酶学性质；基因克隆腈水合酶（Nitrile hydratase，EC4.2.1.84）是一类可以催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶[1]，其最初是由日本学者Asano发现并命名的。
微生物的腈水合酶作为生物催化剂应用在有机物合成的工艺上具有巨大的潜力，它的反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚损失少，具有区域选择性、立体选择性和光激活性，可广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。
更重要的是，它环境污染小、成本低、符合绿色化工发展理念，有着化学方法无法替代的优越性，从而促进了精细化工产品、可降解塑料和手性药物以及维生素等方面的研制和开发。
因此，20多年来一直受国内外研究者的广泛关注。
1腈水合酶的产生菌及其结构无论是腈类物质还是酰胺类物质对人体来说都是极其有毒的[2]，然而有些微生物却能利用它们作为自身生长的碳源和氮源。
原因就在于这些微生物能够自身合成降解腈类物质的酶—腈水合酶（NHase），腈水合酶是某些微生物在进行肟或尿代谢过程中所产生的一种蛋白[3]。
目前已知可产腈水合酶的菌株有红球菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、棒状杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、短杆菌等。
可见产腈水合酶的菌的分布相当广泛[4]。
不同菌株的腈水合酶在结构上存在着一定的差异，但是也存在来自不同菌株的腈水合酶在结构上的相同。
尽管不同菌株的腈水合酶在氨基酸序列上存在差异，但是它们仍然存在着一个共同点，那就是在酶的活性部位都含有螯合的金属离子作为辅助因子。
根据所含辅助因子的不同，腈水合酶可分为2类，一类为高分子量腈水合酶（H-NHase），其所含金属离子为钴；另一类为低分子量腈水合酶（L-NHase），其所含金属离子为铁。
尽管铁型和钴型腈水合酶在氨基酸序列上具有极大的同源性，但这2种酶在生物转化活性和底物特异性上还是有着很大的差异。
腈水合酶研究进展摘要从腈水合酶的结构、分布、酶学性质及其基因克隆和生产中的利用形式等方面简要阐述了腈水合酶的研究进展。
关键词腈水合酶；酶学性质；基因克隆腈水合酶（Nitrile hydratase，EC4.2.1.84）是一类可以催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶[1]，其最初是由日本学者Asano发现并命名的。
微生物的腈水合酶作为生物催化剂应用在有机物合成的工艺上具有巨大的潜力，它的反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚损失少，具有区域选择性、立体选择性和光激活性，可广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。
更重要的是，它环境污染小、成本低、符合绿色化工发展理念，有着化学方法无法替代的优越性，从而促进了精细化工产品、可降解塑料和手性药物以及维生素等方面的研制和开发。
因此，20多年来一直受国内外研究者的广泛关注。
1腈水合酶的产生菌及其结构无论是腈类物质还是酰胺类物质对人体来说都是极其有毒的[2]，然而有些微生物却能利用它们作为自身生长的碳源和氮源。
原因就在于这些微生物能够自身合成降解腈类物质的酶—腈水合酶（NHase），腈水合酶是某些微生物在进行肟或尿代谢过程中所产生的一种蛋白[3]。
目前已知可产腈水合酶的菌株有红球菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、棒状杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、短杆菌等。
可见产腈水合酶的菌的分布相当广泛[4]。
不同菌株的腈水合酶在结构上存在着一定的差异，但是也存在来自不同菌株的腈水合酶在结构上的相同。
尽管不同菌株的腈水合酶在氨基酸序列上存在差异，但是它们仍然存在着一个共同点，那就是在酶的活性部位都含有螯合的金属离子作为辅助因子。
根据所含辅助因子的不同，腈水合酶可分为2类，一类为高分子量腈水合酶（H-NHase），其所含金属离子为钴；另一类为低分子量腈水合酶（L-NHase），其所含金属离子为铁。
尽管铁型和钴型腈水合酶在氨基酸序列上具有极大的同源性，但这2种酶在生物转化活性和底物特异性上还是有着很大的差异。
Tsujimura[5]等通过X-ray以及傅立叶变换离子回旋共振质谱分析证明，腈水合酶由αβ亚基以二聚体（αβ）2的形式存在，每个亚基的分子量大约为23KDa，酶的光学活性催化中心上的非铁血红素与3个半胱氨酸残基（αCys109，αCys112和αCys114）上的硫原子、主链αSer113和αCys114上的2个酰胺氮原子配位。
3个半胱氨酸残基中，αC ys112、αCys114在转录后分别被修饰成Cys-SO2H、Cys-SOH，Cys112被Nagashima等通过质谱得到明确证明，这种修饰是腈水合酶发挥活性所必不可少的。
而对αCys114的修饰可能由于自身的不稳定，在晶体结构上不易检测。
αCys112、αCys114作为酶的活性中心与金属离子（Fe或Co）[6]形成稳定的八面体结构。
Piersma等进一步的定点突变研究表明，来自红球菌N-771的铁型腈水合酶β亚基上的56位以及141位的精氨酸参与了修饰后的半胱胺酸残基的定位，调整活性中心铁的电子态以适于催化。
2腈水合酶的酶活及产酶条件优化研究最早提出使用微生物法生产酰胺的是法国研究者Galzy及其研究组，他们发现了一组催化腈水解的微生物Brevibacterium R312，当时酶活较低。
随后日本学者对产腈水合酶菌做了大量研究工作。
1982年，京都大学山田秀明研究组发现了Pseudomonas Chloraphis B32，经过对其驯化使其酶活达到1 260个单位。
1988年，山田秀明等又发现了一种性能更好的腈水合酶产生菌Rhodococcusrhodococcus J-1，其酶活可达1 630个单位，一度成为日本酰胺生产的工程菌。
我国1984年开始该技术的研究工作，经过10余年的不懈努力，上海生物工程中心培养的菌种产酶活达到了2 837个单位，与日本1991年用于工业生产的J1菌种处于同一水平[7]。
底物或产物浓度达到一定量时会对腈水合酶产生菌带来一定毒性，因而其高产菌株大都是通过重复继代培养，不断提高其耐受性并不断优化产酶条件而获得的。
目前国内在菌株的驯化方面做得比较成熟。
从不同菌株出发，几乎得到了相同的产酶优化条件：葡萄糖浓度为20g/L，诱导剂脲添加量为0.06g/L，钴加入量为0.3g/L，温度为30℃，培养基初始pH值为7.0[8]。
腈水合酶是一种可溶性的诱导酶，诱导剂在腈水合酶的合成过程中具有决定性的作用，只有在培养体系中加入特定的诱导剂后，腈水合酶的活力才能显著提高。
与其他诱导酶不同，腈水合酶常会受到其催化产物的诱导而非底物。
3腈水合酶基因的克隆目前生产腈代谢酶系的野生菌在应用中存在酶稳定性差、对底物和产物的耐受性不强及间歇生产、产品质量不稳定等问题，更为突出的是大多数腈水合酶产生菌的同时也会产酰胺酶，酰胺酶会使腈水合酶催化的产物酰胺转化为相应的酸，从而在一定程度上降低酰胺的产量。
为了解决这些问题，从20世纪80年代末期以来，各国研究者纷纷采用了基因克隆的手段。
基因工程菌表达腈代谢酶系有很多野生菌不可替代的优点，如腈水合酶基因可单独克隆，不会相互干扰，不会因产酸降低了发酵液的pH值而抑制腈水合酶的活性，基因工程菌背景清晰，有利于对基因表达调控机理进行深入研究，同时它的适应性强，发酵周期短，有利于实现大规模培养和工业化生产，从而有着更广阔的应用前景。
腈水合酶以基因簇的形式存在，即编码不同蛋白的多个基因片断按照一定的顺序首尾相连地排列在一起，由1个启动子启动它们的表达，表达的蛋白大多能相互调控、相互协作完成一系列代谢功能。
早在1991年Nishiyama[9]就在绿阵假单胞菌中发现，腈类化合物代谢基因的核苷酸序列中含有编码5种蛋白的开放阅读框，分别为酰胺酶基因、腈水合酶α亚基基因、腈水合酶β亚基基因、p47k 基因和orfE基因，在不同菌株的腈水合酶基因簇中，这5个开放阅读框的排列可能会有所差异，它们的方向及位置关系表明，这些基因是由一条mRNA共同转录的。
克隆腈水合酶时，首先要得到野生菌株的尽可能多的基因信息，一般都是以标准的方法提取野生菌的全部基因组DNA，然后进行测序或通过查阅多种基因文库确定该菌株中的腈水合酶基因序列，根据两端的序列设计探针，并以PCR的方法扩增得到的克隆片断，反应条件由探针的长度和性质决定。
然后将商用质粒和扩增片断通过酶切后连接在一起，构建新型质粒，再转入宿主菌中表达。
虽然已经克隆并测序了多种编码腈水合酶的α和β亚基的基因，但在大肠杆菌作为宿主的体系中，由于基因在新的机制下启动和调控受到一定的限制，表达出的蛋白又易聚集而形成包含体，所以蛋白的过量表达和活性表达都遇到了相当大的困难，在过去的10多年中进展缓慢[10]。
毕赤酵母也是一种用于外源蛋白表达的理想宿主菌，近年来它的应用越来越广泛。
Wu等用基因工程毕赤酵母通过共表达3个同源蛋白成功地表达了具有立体异构选择性的腈水合酶。
同时还由于基因被整合到毕赤酵母的染色体上从而稳定遗传，因而解决了因质粒的不稳定性所带来的诸多问题。
另外，枯草芽孢杆菌表达体系可以将外源蛋白分泌到胞外或细胞周质中，减少形成包含体的可能，这为重组腈水合酶的活性表达又提供了一条新途径。
除此，各国研究者对强化腈水合酶的活性表达提出了各种思路，包括同时克隆基因表达所必需的上下序列[11]、强化翻译后修饰作用[12]、新型宿主载体系统[13]以及基因突变[14]等。
4腈水合酶的利用形式包埋法即利用线状或网状的高分子聚合物将细胞截留在网格空间内，使其成为一种既保持本身催化活性又在生物催化反应后可以回收和重复使用的生物催化剂。
主要包埋载体有海藻酸钠和PAM。
用海藻酸钠包埋，原料易得，无毒性，操作简单安全，但存在机械强度低、通透性差、细胞易流失、产品质量不高等缺点。
用PAM包埋可在较大范围内改变固定化细胞的机械性能和凝胶孔的大小。
凝胶颗粒柱微生物分解性强，机械强度高，化学性能稳定；缺点是固定化细胞成型性和可控性不好。
制备过程中常出现细胞会受化学试剂生理毒性和其他因素的影响，导致固定化细胞酶活力损失很大。
游离细胞法即将游离细胞悬浮于底物溶液中，使底物和反应产物较易通过细胞膜，从而提高了反应速率。
此法操作工艺简单，腈水合酶的催化效率很高；但存在以下缺点：设备投资大，操作费用高，膜污染等。
目前国内主要采用此法完成细胞分离和洗涤过程，然后将游离细胞投入生物反应器反应，再将得到的水合反应液用截留分子量为60KDa左右的超滤膜进行过滤。
目前国外所采用的生物反应器形式多种多样，有搅拌罐式的、填充床式的、流化床式的等。
各种反应器各有利弊，需权衡得失进行选择。
反应器是腈水合酶利用形式的发展方向。
5结语随着世界各国对化工原料丙烯酰胺需求的不断增加以及它所具有的光学活性在制药领域的应用，人们对于腈水合酶的研究必定会更加深入。
对于腈水合酶产生菌的筛选育也是一件十分有意义的工作，目前国内外有不少实验室已筛选到了酰胺酶缺陷型菌株，但其腈水合酶的活性并不理想，希望不久的将来研究人员能够在这方面有所突破。
为了使微生物法生产丙稀酰胺得到更加广泛应用，研究者还需对高产腈水合酶野生菌进行深入细致地研究，包括这些菌株的全部基因组序列和结构的特征。
在丙烯酰胺的实际生产中，酶活的不稳定性成为阻碍连续生产的关键，最本质的解决方法需要从基因工程的角度，找到基因序列的改变对于氨基酸序列、肽键的折叠方式以及亚基空间构象的影响，构建使酶能够稳定活性表达的突变菌株，不仅使微生物法生产丙烯酰胺的工艺得到进一步发展，又为我国水处理、造纸等传统工业的发展注入新的活力。
伴随着一些新兴学科——生物信息学、蛋白质组学等的不断成熟，再结合基因工程技术，产腈水合酶的重组体在生产中也会大有作为。
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