第7章 蛋白质的分离纯化和表征

2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(三) 蛋白质的扩散和扩散系数 平移扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为平移扩散 扩散系数：当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积 所扩散的溶质的量。
蛋白质的扩散系数与分子大小和形状及溶剂的粘度有关。
扩散过程受到蛋白质分子与溶剂间的内磨擦阻力所反抗，这种阻 力大小不仅取决于蛋白质分子的质量，并且还强力地取决于它的 颗粒形状。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
•分离蛋白质的目的 许多蛋白质的研究与应用都要获得 纯蛋白质。如研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理 化学性质，需要纯的、均一的甚至是结晶的蛋白质样品 。 •分离和纯化蛋白质方法的原理 根据蛋白质的之间的各 种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶 解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力进行 分离。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(四) 利用选择性吸附的纯化方法 1.羟磷灰石层析 2.疏水作用层析(苯基琼脂糖、辛基琼脂糖) (五) 利用对配体的特异生物学亲和的纯化方法 (六)高效液相层析和快速蛋白质液相层析
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(一) 蛋白质含量测定 凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法 （Bradford）、胶体金测定法等。 (二)蛋白质纯度鉴定 电泳、沉降、HPLC、SDS－PAGE等。
二、蛋白质分子的大小与形状
(一) 根据化学组成测定最低相对分子质量
•如果已知蛋白质分子中含某种微量元素，并已知其含量，则可测 定此微量元素的含量，计算出最低相对分子质量。

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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
分子筛层析
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
按照分子量大 小分离开
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(三 )
第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
盐析和有机溶剂沉淀 盐溶：中性盐低浓度时，可以增加蛋
双缩脲
Cu2+ CuSO4
(硷性溶液)
红紫色络合物
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第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
Folin－酚试剂法
Lorry法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第 二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了 检测蛋白质的灵敏度。 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨 酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合 物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
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4. 蛋白质变性与复性
第 7 章 蛋 白 质 的 分 离、 纯 化 和 表 征
5. 蛋白质的紫外吸收光谱
蛋白质在远紫外光 区 （ 200-230nm ） 有 较 大的吸收，在 280nm 有
一特征吸收峰，可利用
这一特性对蛋白质进行 定性定量鉴定。
测定范围：0.1～0.5mg/ml
结构 高级结 构破坏
功能 生理功 能丧失
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第 7 复性（renaturation） 章 蛋 变性的可逆性 白 可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。 不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。 质 的 蛋白质的变性作用如果不过于剧烈， 分 则是一种可逆过程 离、 纯 化 胃蛋白酶加热至80℃－90℃时，变性、无消化蛋白质的 能力，失去溶解性。如将温度下降到37℃，就复性，又 和 恢复溶解性和消化蛋白质的能力。但如变性时间加长， 表 条件加剧，变性程度加深，就成为不可逆变性。 征

第七章蛋白质的分离、纯化与表征一、是非题1 一个蛋白质样品，在某一条件下用电泳检查，显示一条带。

因此说明，该样品是纯的（）2 逆流分溶和纸层析，这两个分离氨基酸的方法是基于同一原理（）3 蛋白质的SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳和圆盘电泳是两种完全不同的技术（）4 凝胶过滤法可用于测定蛋白质的分子量，分子量小的蛋白质先流出柱，分子量大的后流出柱（）5 蛋白质在小于等电点的PH溶液中，向阳极移动，而在大于等电点的PH溶液中，将向阴极移动（）6 电泳和等电聚焦都是根据蛋白质的电荷不同，即酸碱性质不同的两种分离蛋白质混合物的方法（）二、填空题1 现欲分离某蛋白质溶液中的四个蛋白质成分，它们分子量和等电点列于表内蛋白质成分Mr pIA 12000 10B 62000 4C 28000 7D 9000 5如不考虑次要因素，它们在葡聚糖凝胶G-75柱上分离时，流出的先后次序将是：最先，，其次，最后流出的蛋白质是如选用羧甲基纤维素柱分离上面四种蛋白质，并用盐浓度梯度洗脱，流出的先后次序将是：、、、2 分离蛋白质混合物的各种方法主要根据蛋白质在溶液中的下列性质，，，3 蛋白质时两性电介质，当溶液的PH在其等电点以上时蛋白质分子带电荷，而PH在等电点一下时，带电荷三、选择题1.下列哪种方法可得到蛋白质的“指纹”图谱?A.酸水解，然后凝胶过滤B.彻底碱水解并用离子交换层析测定氨基酸的组成C.用氨肽酶降解并测定被释放的氨基酸的组成D.用胰蛋白酶降解，然后进行纸层析和纸电泳E.用2，4-二硝基氟苯处理蛋白质2.若用电泳分离Gly-Lys、Asp-Val和Ala-His三种二肽，在下列哪个pH条件下电泳最为合适？A.pH2以下B.pH2～4C.pH7～9D.pH10～12E.pH12以上3.进行疏水吸附层析时，以下哪种条件比较合理A.在有机溶剂存在时上柱，低盐溶液洗脱B.在有机溶剂存在时上柱，高盐溶液洗脱C.低盐条件下上柱，高盐溶液洗脱D.高盐溶液上柱，按低盐，水和有机溶剂顺序洗脱。

楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
3.毛细管电泳
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
4.等电聚焦电泳
等电聚焦电泳法测定蛋白质pI
5.SDS-PAGE
6.离子交换层析
离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：
楚雄师范学院化学与生命科学系
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范树国
普通电泳、等电聚焦、 双向电泳、脉冲电泳、 毛细管电泳 从电泳结果分：自由界 面电泳、区带电泳、盘 状电泳 从装置上分： 圆盘电 泳（柱状）、水平板电 泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界 面电泳、纸电泳（或薄 膜电泳）、凝胶电 泳（ PAGE ，琼脂糖胶， 淀粉胶等）
沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降 的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰 冻切片采样分析。
蔗糖密度梯度
聚蔗糖密度梯度
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范树国
3.凝胶过滤
交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ）；琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）
稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀。 ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集 而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液 中析出沉淀。
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范树国
（二）蛋白质的沉淀
①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、 Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数。 ③重金属盐沉淀 pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与 重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电点时，蛋白质 带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、 苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀 往往是不可逆的。