蛋白质和酶的分离纯化及鉴定
蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。
目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。
一、质分离纯化的一般原则
1. 原料的选择
原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。
蛋白分布：体液、组织、细胞定位
2. 破碎方法：
(1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。
如：捣碎法、研磨、匀桨法
(2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
如：反复冻融、渗透压、超声破碎
(3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.
如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）
(4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等
3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法
4. 先粗后细，分级分离
粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。
精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。
5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化主要包括“前处理”，“粗分级”，“细分级”三个步骤，本文主要讲述“细分级”，即粗提的蛋白质分离纯化的方法。
蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质不同的生理特性有不同的方法分类，主要根据以下几个性质来设计纯化方法：
一、 根据分子大小不同分离纯化：
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
1、透析和渗滤：
主要利用半透膜
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。
2、离心
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离。
3、凝胶过滤
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
二、 根据溶解度不同分离纯化
第一节 蛋白质的酸碱性质
各个解离基团的pK值与游离氨基酸的不完全相同。
等电点要用等电聚焦等方法测定。
第二节 蛋白质分子的大小与形状
一、根据化学组成测定最低相对分子质量
假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。
若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。
例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu的百分含量计算，最低Mr X1：
X1=(100´ 131)/1.65=7939.4。
按照Ile的百分含量计算最低Mr X2：
X2=(100´ 131)/2.48=5282.3。
由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算：
X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。
这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为：
7939.4 ´2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。
二、渗透压法测定相对分子质量
三、沉降分析法测定相对分子质量 基本原理：
（一）离心力(centrifugal force，Fc)
当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义：
F=m·a=m·ω2 r
a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。
（二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF)
由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
7.1 本章主要内容
1）蛋白质的酸碱性质
2）蛋白质分子的大小和形状
3）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
4）蛋白质分离纯化方法
7.2 教学目的和要求：
通过本章学习，使学生掌握蛋白质的物理化学性质，在此基础上对现实生活中的现象给出合理的解释，同时为后续知识的学习打下基础。
7.3 重点难点
1.蛋白质分离纯化方法
2.蛋白质物理化学性质及应用
7.4 教学方法与手段
讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。
7.5 授课内容
一、 蛋白质的酸碱性质
蛋白质也是一类两性电解质，能和酸、碱发生作用。
在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。
天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基因由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。
1.等电点和等离子点（中性盐Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）
等电点：以兼性离子形式存在的蛋白质的pH 值。在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。
蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。
等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。 2.蛋白质的电泳分离
3.离子交换层析分离蛋白质
二、 蛋白质的大小与形状
测分子量的方法：
1.化学组成法
2.凝胶过滤法
3.SDS-PAGE法
4.沉降分析法
5.渗透压法
三、 胶体性质与蛋白质的沉淀
蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）
透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基因数量越多，溶解度越大。
