氯酚类化合物的微生物降解研究进展＊姜 梅 牛世全 展惠英 袁建梅 陈 慧＊＊(西北师范大学,兰州730070)【摘要】 综述了近年在具有降解氯酚类化合物能力的微生物的筛选、氯酚类化合物的好氧和厌氧降解机制以及现代生物技术的开发利用研究.阐述了氯酚类化合物在不同条件下的降解路径.在好氧条件下,单氯酚和二氯酚在氧化酶的攻击下形成氯代邻二酚,邻二酚开环生成相应的氯代粘康酸或半醛,粘康酸内酯化过程中释放氯离子;高度氯代的化合物则是在氢氧化酶作用下生成氯代醌,并逐步脱去所有的氯原子生成苯酚后才开环.在厌氧或缺氧条件下,氯酚进行还原脱氯,在得到电子的同时去掉一个氯取代基.关键词 氯酚类化合物 好氧降解 厌氧降解 生物降解性 生物技术文章编号 1001-9332(2003)06-1003-04 中图分类号 X171 文献标识码 AResearch advances in biodegradation of chlorophenols in environment .JIAN G Mei ,N IU Shiquan ,ZHAN Huiy -ing ,Y UA N Jianmei ,CHEN Hui (Northwest Normal University ,L anzhou 730070,China ).-Chin .J .Appl .Ecol .,2003,14(6):1003～1006.T his paper examines the biodegrada tio n of chlorophenols by microbes and deals with the chlo rophenols -deg rading microbes and the usage of bio technology w ith special emphasis on deg radation mechanisms .Dechlo rination is the first critical step in the bacterial deg radation of many chlo ro niated pollutants .Under aerobic condition ,the deg radation of mono -and dichlorophenols is show n to be initiated by oxyg enation into chlorocatechols ,and dechlo rinatio n occurs only after ring cleavage of the chlo rocatechols .T he degradation of polychlo rinated phenols starts by hydroly tic para -hydroxylation ,yielding chlorinated para -hy droquinone .T he anaerobic biodeg radation of chlo rophenols occurs by reductive dechlorination ,a process by w hich chlo rines are replaced with hydrogen .Key words Chlorophenols ,Aerobic deg radation ,Anaerobic degradation ,Bioderadability ,Bio technology .＊国家自然科学基金资助项目(29977015).＊＊通讯联系人.2001-11-23收稿,2002-04-01接受.1 引 言自20世纪30年代以来,氯酚类化合物(CPs )被广泛用作木材防腐剂、防锈剂、杀菌剂和除草剂等,在亚洲、非洲和南美洲还用于血吸虫病的防治,其中2,4-二氯酚(DCP )和2,4,5-三氯酚(T CP )还大量用于农药2,4-D 和2,4,5-T 的生产,因此在许多工业化国家CPs 的生产规模非常庞大.同时2-氯酚,2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚和五氯酚都是毒性很高的物质,被美国EPA 列入优先控制污染物的黑名单[25].氯酚类化合物的大量使用,使得大量的CPs 污染物进入了环境,给自然环境造成很大的危害[27].因此,清除环境中的该类化合物是人类面临的一大挑战.人们早就发现微生物对自然界有机物的循环起着重要的作用[4].随着工农业的快速发展,进入环境中的外来物越来越多,其中许多有机污染物对微生物有抑制作用,甚至杀灭作用.但是经过长期的接触驯化,有些微生物能通过自然变种,或形成诱导酶,具备了新的代谢功能,从而能降解或部分转化外来化合物.微生物对外来化合物降解或转化的巨大潜力,引起了国内外学者的广泛兴趣.筛选高效的降解菌株,研究污染物的降解机理,以及应用新型现代生物技术加强有机污染物的生物降解是研究微生物降解有机污染物的主要方向.本文就氯酚类化合物在这几方面所开展的一系列工作进行综述.2 具有降解氯酚类化合物能力的微生物氯酚类化合物进入环境已有几十年,有些微生物通过长期自然进化具有降解氯酚类化合物的能力.对此人们进行了多年的研究,现已分离出具有降解氯酚类化合物能力的多种微生物菌株(表1).由表1可以看出,许多微生物能参与氯酚类化合物的降解反应.其中假单胞菌是降解氯酚类化合物最常见的微生物,不仅能降解多种氯酚[22],而且能降解氯苯、多氯联苯、硝基苯和多环芳烃等近100种有毒物质[21,23,29,32].黄孢原毛平革菌(Phanerochate chryso sporium )是对氯代酚化合物具有非专一性降解作用的真菌,还能降解菲、葸等多环芳烃和多氯联苯及其各种染料等[2,17].3 氯酚类化合物的降解机制3.1 氧化脱氯3.1.1先开环再脱氯 在Ps eudomonas sp .好氧培养中,单氯酚和二氯酚首先在单氧化酶作用下发生邻位氧化,生4-氯代儿茶酚降解机制见图1[16].成氯代儿茶酚[6];氯代儿茶酚在1,2-双加氧酶的作用下发生邻位开环生成氯代顺,顺-粘糖酸,内酯化过程中释放出氯离子,并被氧化成马来酰基应用生态学报 2003年6月 第14卷 第6期 CHIN ESE JO U RNA L OF A PPL IED ECOLO GY ,Jun .2003,14(6)∶1003～1006表1 具有降解氯酚类化合物的纯培养微生物Table1Chlorophenols-degrading microbes in pure cu lture氯酚Chlorophenols微生物M icrobes2-氯酚2-ch l orophenol产碱杆菌Alc a ligenes sp.,固氮菌Azotobacter sp.,恶臭假单胞菌Pseudomonas putida,洋葱假单胞菌Ps.cepacia,Desu lfovibr io dechloracetivorans,Ralstonia sp.,Cystobacter i sp.3-氯酚3-ch l orophenol Desulfomomile tiedjei4-氯酚4-ch l orophenol恶臭假单胞菌Ps.putida,洋葱假单胞菌Ps.cepacia,产碱杆菌Alca ligenes s p.,固氮菌Azotobactersp.,睾丸酮丛毛菌C oma monas testosteron i JH5,Ralstonia sp.2,3-二氯酚2,3-dichlorophenol Desulfitobacter iu m deha l ogenans,Desulfomomile tiedjei2,4-二氯酚2,4-dichlorophenol洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia c epacia(Ps.cepacia),皮氏假单胞菌Ps.pickettii.,梭状芽孢杆菌Clostr idium sp.,Desu lfitobacterium dehalogenans,Des u lformonil e tiediei,R alston ia sp.2,5-二氯酚2,5-dichlorophenol Desulfomon ile tiedjei,Desulfovibrio dechlor acetivor ans2,6-二氯酚2,6-dichlorophenol Desulfitobacter iu m dehalogenans,Ralstonia sp.分枝杆菌Mycobacter iu m ch lophenolicum,洋葱假单胞菌Ps.cepacia,固氮菌Az otobacter sp.3,4-二氯酚3,4-dichlorophenol皮氏假单胞菌Ps.pickettii,Desulfor ibrio dechlorac etivorans3,5-二氯酚3,5-dichlorophenol皮氏假单胞菌Ps.pickettii2,3,4-三氯酚2,3,4-trichlorophenol梭状芽孢杆菌Cl otrid ium sp.,皮氏假单胞菌Ps.pickettii,Desulfovibrio dech loracetivorans2,4,6-三氯酚2,4,6-trichlorophenol黄孢原毛平革菌Phanerochate chrys ospor iu m,固氮菌Azotobacter sp.,梭状牙孢杆菌Clostrid iu m sp.,皮氏假单胞菌Ps.picketti,Desulfitobacteriu m deha l ogenans,Desulfomonile tiedjei2,4,5-三氯酚2,4,5-trichlorophenol梭状芽孢杆菌Cl ostridium sp.,皮氏假单胞菌Ps.pic ketti四氯酚Tetrachlorophenols皮氏假单胞菌Ps.picketti,节杆菌Arthrobacter sp.,Ralstonia sp.五氯酚Pentachlorophenol黄杆菌F lavobacterium sp.,梭状牙孢杆菌Cl ostr idium sp.,洋葱假单胞菌Ps.cepacia,红球菌Rhodococcus s p.,Desulfitobacterium frap pier,Desulfitobacter iu m deha l ogenans,Desulfomonil etiedjei图1氯代儿茶酚的邻位开环Fig.1Degradation pathway for chlorocathol via orth ring fis sion.A:1,2双加氧酶1,2-dioxygenas e.乙酸进入三羧酸循环. 通常认为,在芳香烃的生物降解过程中,当取代基是烷烃时,儿茶酚发生间位开环;氯代芳烃则经邻位开环.但近年的研究表明,在一定的条件下,氯代芳烃好氧降解过程中氯代儿茶酚也存在间位开环[10].Hollender等[11]在以4-氯酚和甲基苯酚为底物富集培养过程中筛选得菌株Comamonas testoteroni JH5,能同时降解4-CP和4-M P.对其降解中间体及降解酶的检测都证实在该菌的作用下,4-CP是经间位开环降解的,降解路径如图2.在经甲酚驯化的Alcaligenes eu-trophus JM P222对2,4-DCP和Ps eudomonas cepacia P166对4-氯苯甲酸降解过程中氯代儿茶酚的间位开环也得到了证实[16].氯代儿茶酚的间位开环的发现使得氯代芳烃和甲基芳烃,这两种曾认为是生物代谢不相容的两类化合物的同时降解成为可能,为代谢不相容化合物的生物降解提供了新的思路.3.1.2先脱氯再开环 从PCP污染环境中筛选得到的Flavobacterium sp.和Rhodococcus chlorophenolicus能降解PCP和其它一些多氯酚[14].在好氧条件下,它们先将CPs苯环氧化生成氯代醌,然后再逐步脱去氯取代基生成单氯酚或苯酚.Flavobacterium sp.对PCP的降解路径如图3[3]. Deng-Yu L等[6]发现,在2,4,6-TCP的降解菌株Azoto bacter sp.G P1对酚类化合物的降解过程中存在上面两种降解路径:苯酚的降解是经儿茶酚降解的;2,4,6-TCP和2,6-DCP 图2 4-氯酚的间位开环降解路径Fig.2Degradation pathw ay for the mechanism of4-CP via meta ring fis-sion.B:2,3-双加氧酶2,3-dioxygenas e.图3 五氯酚的好氧生物降解路径Fig.3Aerobic degradation pathw ay for PCP.的降解首先对位氧化生成醌.K izy ohora等[14]报道了经2,4, 6-T CP诱导的Pseudomonas pickettii菌株DT P0602可将含对位氯的酚转化成相应的氯醌;而经4-CP诱导时,该菌能将邻位缺氯的氯酚经氯代儿茶酚的路径降解.3.2 还原脱氯机制 还原脱氯是指氯酚类化合物在得到电子的同时去掉一个氯取代基并释放一个氯阴离子的过程.这种脱氯机制多发生在厌氧和缺氧条件下,是氯代芳香化合物生物降解的重要途径[8,12,26].因氯原子强烈吸引电子云使苯环上电子云密度降低,在好氧条件下氧化酶很难从苯环上获取电子而发生氧化反应;相反,在厌氧条件下,环境氧化还原电位较低,电子云密度较低的苯环在酶作用下易受到还原剂的亲核攻击,氯1004应 用 生 态 学 报 14卷原子就很容易被亲核取代,许多在好氧条件下难于降解的化合物在厌氧条件下变得容易降解[8,31]. James 等[12]从河底淤泥筛选出一株能在厌氧条件下利用2-CP 生长的细菌.该菌生化特征革兰氏阴性杆菌,接触酶、氧化酶阴性,初步鉴定属Cysto bacterincae 在厌氧条件下,该菌能以乙酸盐为电子供体,将2-CP 还原脱氯产生苯酚.在多氯酚的微生物降解过程中,人们发现邻位氯取代基较间、对位的氯取代基容易还原脱除.M adsen 等[18]研究了TCPs对微生物的毒性及其稳定产甲烷菌培养液对2,4,6-T CP 的降解.结果表明2,4,6-T CP 的转化路径是:依次脱去邻位氯取代剂生成2,4-DCP 和4-CP ;3种T CP s 对微生物的毒性由小至大依次为2,4,6-TCP <2,4,5-TCP <3,4,5-T CP . 由于PCP 应用的广泛性和相对易于厌氧降解,在氯酚类化合物中PCP 的厌氧降解研究最多[1,5,28].日本有关水稻地中PCP 的分布和归趋的研究提供了PCP 厌氧降解的最早报导[6].I de 等第一次证实,四氯酚(T eCPs )和三氯酚是厌氧微生物还原PCP 的产物;而后Broyd ,M ikesell 和W oods 等分别在用厌氧活性污泥对PCP 降解过程中发现,羟基邻位的氯原子较间、对位的容易被取代.Nishino 等[20]在经PCP 驯化的产甲烷菌对CPs 还原脱氯时有相似的结论:在驯化10天的产甲烷菌的作用下,PCP 的脱氯主要发生在羟基邻位,当驯化时间为6个月,PCP 的脱氯可在邻、间、对三位同时发生.图4是驯化甲烷菌对PCP 降解示意图.然而微生物种群不同,环境条件不同,相同化合物会显示不同的代谢途径.我国周岳溪等[33]研究了升流式厌氧污泥床反应器在中温条件下处理含PCP 废水时,检测结果表明,PCP 厌氧降解途径是首先经间位脱氯生成2,3,4,6-T eCP ,进一步间位脱氯生成2,4,6-T CP ,然后经邻位脱氯生成2,4-DCP ,再经对位脱氯生成邻氯苯酚,最后矿化生成甲烷和二氧化碳.图4 产甲烷菌作用下五氯酚的降解路径Fig .4Reductive dechlorination pathw ay for PCP by a PC P -accl imated methanogenic consortium . 尽管在厌氧或缺氧条件下氯酚类化合物生物降解方面的研究表明,在适宜的条件下,厌氧环境中存在大量潜在的降解氯酚的微生物.但至今已发现的具有还原脱氯作用的厌氧微生物仅有3种:Desulfomonile tiedjei DCB -1、Desulfito -bacterium dehalogenans JW /IU -DC1和Desul fitobacterium chlororespirans .这是因为大多数还原脱氯需要多种微生物的参与,首先多种微生物共存易于创造厌氧环境;其次,一种微生物要靠其他微生物作为电子受体和供体;另外一种微生物可以借助其他微生物消除抑制性的中间代谢产物,从而使降解进一步完成[19,24,30].4 新型生物技术的开发利用4.1 基因工程菌开发利用 从自然界筛选驯化获得的土著菌,其降解污染物的酶活性往往有限,同时酶作用的专一性使得微生物对有机污染的降解局限于一种或结构相似的几种化合物.但是从氯酚类化合物的生产和进入环境后所处的系统来看,它总不是单一存在的,而是由多种有机物、多种组分共存.因此对这些菌进行遗传学改造,构建符合实际需求的工程菌成为必要;降解质粒的发现、细胞融合技术和DNA 重组技术等现代生物技术使得构建高效降解工程菌成为可能.R .A .Haugland 用Ps eudomo as putida AC1100(2,4-D 的降解菌)和Alicaligenes eutrophus JM P134(2,4,5-T 的降解菌)进行细胞融合得到一新工程菌RHJ1,可同时降解2,4-D 和2,4,5-T [13].4.2 细胞固定化技术 游离菌体受环境因素影响大,且在生物反应器中易随着反应液的流出物流失,从而影响降解效果.为此,人们开始采用细胞固定化方法,将菌体包埋或吸附于载体中,增强菌体对外界因素的抵抗力,提高其降解能力.Piero M .Armenanto 等[7]分别将Phanerochaete chrysosporium 菌体包埋于硅胶载体和轻木颗粒中降解2-氯酚的实验表明,固定化细胞降解率远远高于游离细胞.目前对载体的研究是一个新热点.4.3 酶工程 微生物对有机污染物的降解归根结底是通过其分泌的酶来完成的,直接采用酶进行有机污染物的降解比微生物修复更具优势:如酶不受微生物代谢抑制剂的影响、酶对环境中营养要求不高、酶在环境中有较大的移动性等.Gianfrada 等[9]发现,固定化后的漆酶和过氧化酶修复2,4-DCP 污染的土壤效果良好.5 展 望 高效降解菌株的筛选及其降解机理的研究使得利用高效降解菌株修复CPs 污染的环境成为可能.但是许多实验表明,当将实验室获得的高效降解菌株投入实际污染现场进行生物修复,往往不能达到预期的效果.因此,如何将实验室驯化出来的微生物应用于实际生物处理或生物修复而保持其降解活性是有待深入研究的课题.其次现代生物技术在有机污染物治理方面的研究大多只是停留在实验室阶段,它们在治理有机污染方面的实际应用是又一值得关注的研究方向.参考文献1 Adrian L ,M anz W ,S zew zyk U .1998.Phys iological characterization10056期 姜 梅等:氯酚类化合物的微生物降解研究进展 of a bacterial consortium reductively dechlorinating1,2,3-and1,2, 4-trichlorobenzene.Appl En viron Microbiol,64:496～5032 Armenante PM,Pal N,Lew andow ski G.1994.Role of mycel ium and extracellular protein in the biodegradation of2,4,6-trichlo-rophenol by Phanerochaete chrysospor ium.Ap pl Envir on Micr obi-ol,66:1711～17183 Chen Y-S(陈勇生),Zhuang Y-Y(庄源益),Dai S-G(戴树桂).1997.A survey on the microbial degradation of chlorinated aromatic compounds.Ad v En viron S ci(环境科学进展),5(2):17～26(in Chines e)4 Chi-Yuan F and Krishnamurthy S.1995.Enzymes for enhancing bioremediation of petroleum-contaminated soils:A brief review.J Air Was ter Manag Ass oc,45:453～4605 Christiansen N,Hendriksen HV,Jarvinen T,et al.1995.Degrada-tion of chlorinated aromatic compounds in UASB reactors.Water Sci Technol,31:249～2596 Deng-Yu L,Eberspacher J,Wager B,et al.1991.Degradation of2, 4,6-trich l orophenol by Az otobacter sp.strain GP1.App l E nviron Microbiol,57:1920～19287 Dong A-M(董爱明).1996.The progress of the biodegradation of chrolophenol s by microbes.Tec h nol Clean Water(净水技术),55(1):18～22(in Chinese)8 Haggbl om M M,Young LY.1995.Anaerobic degradation of halo-genated phenols by sulfate-reducing C onsortia.App l Microbiol Biotec h nol,61:1546～15509 He W-X(和文祥),Jiang X(蒋 新),Zhu M-X(朱茂旭).2001.Advance on enzymes bioremediation of pesticides-polluted.C h in J Ec ol(生态学杂志),20(3):47～51(in Chinese)10 Hollender J,Dott W,Hopp J.1994.R egul ation of chloro-and methylphenol deg radation in Comamomas testosteroni.JH5.App l Envir on Microbiol,60:2330～233811 Hollender J,Hopp J,Dott W.1997.Degradation of4-chlorophenol via the meta cleavage pathway by C omamonas testosteroni JH5.Appl Environ Micr obiol,63:4567～457212 James RC,Cascarelli A,W ill iam WM,et al.1994.Is olation and characterization of a novel bacterium grow ing via reductive dehalo-genation of2-chlorophenol.Ap pl Envir on Micr obiol,60:3536～354213 Jin Z-G(金志刚),Zhang T(张 彤),Zhu H-L(朱怀兰).1997.Biodegradaton of Pollutan ts.Shanghai:East China Univers ity of Technology Press.166～167(in C hinese)14 Kiyohara H,Hatta T,Ogawa Y,et al.1992.Isol ation of Ps eu-domonas pickettii strains that degrade2,4,6-trichlorophenol and their dechlorination of chlorophenols.Appl Environ Micr obiol,58: 1276～128315 Krooneman J,Van S,Teres a A,et al.1999.Degradation of3-chlorobenzoate under low-oxygen conditions in pu re and mixed cul-ture of the A noxygenic photoheterotroph,Phodopseudomonas palustris DCP3and aerobic A lcaligenes species.Ap pl E nviron Mi-cr obiol,65:131～13716 Koh SC,M ccullar M V,Focht DD.1997.Biodegradation of2,4-dich l orophenol through a distal meta-fission pathw ay.Ap pl E nviron Micr obiol,63:2054～205717 Li H-R(李慧蓉).1996.W hite rot fungi an ingenious army for envi-ronmental prtection.Adv E nviron S ci(环境科学进展),4(6):69～77(in Chinese)18 M ads en T,Aamand J.1992.Anaerobic transformation and toxicity of trichlorophenols in a stable enrichment culture.Appl E nviron Microbiol,58:557～56119 M iddeldorp PJ,Alexander M,Zeh nder JB,et al.1997.Enrichment and properties of a1,2,4-trichlorobenzene-dechlorinating metha-nogenic microbial consortium.App l E nviron Microbiol,63:1225～122920 Nishino S F,Paol i GC,Spain JC.2000.Aerobic degradation of dini-trotol uenes and pathway for bacterial degradation of2,6-dinitro-toluene.App l E nviron Microbiol,66:2139～214721 Ortega-Calvo JJ,Fesch C,Harms H.1999.Biodegradation of sorbed 2,4-dinitrotoluene in a clay-rich,aggregated porous medium.Envi-ron Sci Tech nol,33:3737～374222 Park JH,Zhao X,Voice TC.2001.C omparison of biodegradation ki-netic parameters for naphthalene in batch and s and column systems by Ps eudomonas pu tida.Envir on Progr,20(2):93～10223Pettigrew CA,Haigler BE,S pain JC.1991.Simultaneous biodegra-dation of chlrobenzene and toluene by a Ps eudomonas strain.App l Envir on Microbiol,57:157～16224 Qu F-P(瞿福平),Zhang X-J(张晓健),Nu X(吕 昕),et al.1997.Advance on research of biodegradability for chlorinated aro-matic compounds.E nviron S ci(环境科学),18(2):74～78(in Chi-nes e)25 S hi H-C(施汉昌),Zhao Y-H(赵胤慧),Ji J-P(冀静平).1998.S tudy and advance on treatment tech nology of chlorophenols pollut-ed w aste w ater.Bu ll Chem C h in(化学通报),(8):1～4(in Chi-nes e)26 S teinl e P,S tucki G,Stettler R,et al.1998.Aerobic mineralization of 2,6-dichlorophenol by Ra lston ia s p.strain RK1.Ap pl E nviron Microbiol,64:2566～257127 S un B,Cole J R,S anford RA,et al.2000.Is olation and characteriza-tion of Desulfovibrio dechlor acetivor ans sp.nov.,a marine dechlo-rination of acetate to the reductive dech l orination of2-chlorophenol.Appl Environ Microbiol,66:2408～241328 Tartakovsky B,Levesque M J,Dumortier R,et al.1999.Biodegra-dation of pentachlorophenol in a continuous anaerobic reactor aug-mented w ith Desulfitobacteriu m frappier i PCP-1.App l E nviron Microbiol,65:4357～436229 Tros M E,Schraa G,Zehnder AIB,et al.1996.T ransformation of low concentrations of3-chl orobenzoate by Ps eudomonas sp.strain B13:Kinetics and res idual concentrations.Appl Envir on Microbiol, 62:437～44230 Utkin I,Dalton DD,Wiegel J.1995.Specificity of reductive dehalo-genation of s ubstituted orth-chlorophenols by Desulfitobacterium dehalogenans JW/IU-DC1.Appl Envir on Microbiol,61:346～351 31 Utkin J,Woese C,Wiegel J.1994.Isolation and characterization of Desu lfitobacterium dehalogenans gen.,sp.nov.,an anaerobic bac-terium w hich reductively dechlorinates chlorophenolic compounds.In t J S yst Bacter iol,44:612～61932 Zhao JS,S ingh A,Huang XD,et a l.2000.Biotransformation of hy-droxylaminobenzene and aminoprenol by Ps eudomonas p utida 2NP8cells g row n in the presence of3-nitrophenol.Ap pl E nviron Microbiol,66:2336～234233 Zhou Y-X(周岳溪),Hao L-F(郝丽芳),Zhang H-S(张寒霜).1999.A study on the anaerobic treatment of pentachlorophenol w as te water in a UAS B reactor.Res E nviron S ci(环境科学进展), 12(1):24～26(in Chinese)作者简介 姜 梅,女,1974年生,硕士生,主要从事有机污染物迁移、转化和降解方面的研究,发表论文2篇.T el:0931-*******,E-mail:jiang mei77@so 1006应 用 生 态 学 报 14卷。
