斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达作者：陈华林晨韬陈曦葛均青来源：《南方农业学报》2022年第01期摘要：【目的】實现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达，以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白，为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。

【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马鱼g型溶菌酶进行生物信息分析，经密码子优化后合成斑马鱼g型溶菌酶基因，亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，以IPTG进行诱导表达，并通过非干扰型蛋白浓度测定试剂盒和溶菌酶测定试剂盒（比浊法）测定其浓度及溶菌活性。

【结果】从GenBank检索获得的斑马鱼溶菌酶基因g1（NM_001002706.1）和g2（XM_002664371.5）分别命名为Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。

Zeb-Lys-g1基因开放阅读框（ORF）长591 bp，共编码196个氨基酸残基，其编码蛋白分子量约21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF长576 bp，共编码191个氨基酸残基，其编码蛋白分子量约21.1 kD;2种斑马鱼g型溶菌酶序列中均含有2个半胱氨酸残基及3个保守的催化残基位点（Glu、Asp和Asp）。

Zeb-Lys-g1的N端含有17个氨基酸的信号肽，而Zeb-Lys-g2不存在典型的信号肽结构，但其三级结构均具有多个α-螺旋结构。

在基于溶菌酶序列相似性构建的系统发育进化树中，Zeb-Lys-g1序列与金鱼g型溶菌酶序列的亲缘关系最近，而Zeb-Lys-g2序列与鲈形目和鲽形目鱼类的g型溶菌酶序列亲缘关系较近。

将合成的斑马鱼 g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化BL21（DE3）感受态细胞，20 ℃下经IPTG（终浓度0.5 mmol/L）诱导16 h，可获得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2，纯化后的浓度分别为1.01和1.66 mg/mL，对应的溶菌活性分别为689.68和44.39 U/mg。

《基因工程》课程综合实验---转基因斑马鱼的构建实施方案《基因工程》课程综合实验教学在专业培养目标中的定位与目标《基因工程》是生命科学学院等各专业的专业主干课，在这些专业的本科生教学计划中占有极为重要的地位。

《基因工程》也是我们学校基地班和生技专业的专业必修课，已经有10余年的开课历史。

全国其他高等综合院校都十分重视《基因工程》课程建设，绝大多数院校都将《基因工程》作为学校精品课程进行建设。

XX师X大学大学在《基因工程》教学和研究方面具有坚实的基础，2008年《基因工程》建设成为了XX省精品课程，从而为我校《基因工程》的教学改革提供了契机。

基因工程是以遗传学为理论基础的一门实践性很强的学科，是生物学科中一门体系还欠完整却发展十分迅速的学科，对探索生命的本质、推动整个生物学科的发展起着巨大的作用；同时又是一门紧密联系生产实际的实验科学，对新品种选育和良种繁育、遗传疾病防治等都具有重要的应用价值。

通过《基因工程》的学习，使学生掌握基因工程的基本原理、基本方法和最新发展动态；通过《基因工程》课程综合实验教学，使学生熟悉基因工程的基本操作方法，注重对学生的实验操作技能的培养。

基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建教学大纲课程名称：基因工程（实践课程部分）课程编号：面向专业：生物技术、生物科学、基地班课程总学时：理论51学时，实验34学时_实验学时：34_课程学分：理论3学分，实践2学分一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生基因工程基本实验操作、实验设计、实验结果分析和创新实验能力，通过基因工程综合实验的开设，注重学生综合素质和实践能力的培养。

二、实验内容、学时分配与组织三、教学管理模式与注意事项1．学生在实验前必须认真复习课程有关内容，预习实验指导书。

2．指导教师适当讲解相关理论及注意事项，提示具体的实验方法和操作，演示重要仪器的使用。

争鸣如何构建一个真核生物基因在大肠杆菌中高效表达的受体余砚笈由外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理，可以从启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数等方面进行改善构建。

一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。

2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。

而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。

3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。

4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。

5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。

6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。

二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。

启动子是在转录水平上影响基因表达。

转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。

也就是说启动子会有强弱之分。

要获得高效表达必须选择强启动子。

由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。

通常用的强启动子有lac、trp、tac、bla、λp L等，将外源基因插入这类启动子的下游，可以增加基因的表达产量。

三、终止子有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件，因为它们具有极其重要的作用。

贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。

这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。

同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录。

四、核糖体结合位点1、Shine-Dalgarno（SD）序列一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。

p53 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 成 功 表 达 ，表 达 的 p53 融 合 蛋 白 分 子 量 大 约 为 53kD，透 析 复 性 后 获 得 了 高 纯 度
可溶性的 p53 蛋白。
关键词：p53 基因；斑马鱼；原核表达
中 图 分 类 号 ：Q786
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2010）03－0526-03
胞。 挑取单克隆菌落接种于 LB 培养基中，37℃摇荡 过夜， 转接扩大培养至菌液 OD600 达 0．5～0．8 时，加 入 终 浓 度 为 1 mmol ／ L 的 IPTG，37℃ 诱 导 1、3、5h 后，分别取样进行 SDS－PAGE 分析，5 h 后收集菌体 溶 于 溶 菌 缓 冲 液 （50 mmol ／ L NaH2PO4，300 mmol ／ L NaCl，10 mmol ／ L 咪唑，pH 值 8．0） 中， 超声破碎菌 体 ，12 000 r ／ min 离 心 20 min， 分 别 取 上 清 和 沉 淀 进行 SDS－PAGE 分析。 1．2．6 p53 蛋 白 的 变 性 纯 化 及 复 性 参 照 Qiagen 镍柱蛋白纯化操作步骤，在变性条件下纯化以包涵 体形式表达的 p53 蛋白。 采用尿素梯度透析法对纯 化的 p53 蛋白进行复性，尿素浓度梯度分别为 8、6、 4、2，0M。 首先将变性纯化的 p53 蛋白用变性结合缓 冲 液 （8 mol ／ L 尿 素 ，100 mmol ／ L NaH2PO4，100mM Tris－HCl， pH 值 8．0）稀释 5 倍后装入透析袋中，放 置在透析液中 （100 mmol ／ L Tris－HCl，100 mmol ／ L NaH2PO4，1 mmol ／ L EDTA，2 mmol ／ L 还原型谷胱甘 肽，0．2 mmol ／ L 氧化型谷胱甘肽，20％丙三醇，1％甘 氨酸，pH 值 8．0），4℃磁力搅拌透析 12 h， 每隔 12 h 更换含低浓度尿素的透析液，其他成分不变，最后 将 p53 透析至水中，离心去除沉淀，复性的 p53 蛋 白 冷 冻 干 燥 后 经 12％ SDS－PAGE 电 泳 检 测 后 于－ 80℃保存。