原核大肠杆菌蛋白表达

大肠杆菌表达系统总结

随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。

大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列 、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）

菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。

大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。表达载体也是影响外源基因表达的重要因素，它是表达系统中最关键的元件，包括启动子、目的基因、抗性基因和终止子等，表达载体需具有高拷贝数、产量高、应用范围广、表达产物易纯化及稳定性好等特点，应用在大肠杆菌中的载体包括融合表达型载体、分泌型表达载体和共表达载体等，常用的表达载体为pET、pUC、pSC、pPBB、pBV220、 pRK1、pRLK14等，常用的启动子有Ptrp、 Ppho、PL、PR、Ptac、Plac、T7 噬菌体启动子、 trp-lac 杂合启动子等。

大肠杆菌的原核表达实验过程结果

大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：

1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。

2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。

3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。

4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。

5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。

6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。

在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。

目的蛋白的原核表达

目的蛋白的原核表达是一种常见的蛋白质表达方式，它可以通过大量的原核细胞来生产大量的目的蛋白。这种表达方式具有高效、简便、成本低等优点，因此被广泛应用于生物医学研究、工业生产等领域。

在目的蛋白的原核表达中，最常用的表达系统是大肠杆菌表达系统。这种表达系统具有许多优点，如生长速度快、易于培养、表达效率高等。此外，大肠杆菌表达系统还可以通过改变表达载体、调节培养条件等方式来优化表达效果。

在进行目的蛋白的原核表达时，需要选择合适的表达载体。常用的表达载体有pET、pGEX、pMAL等。这些表达载体都具有不同的特点，可以根据需要选择合适的表达载体。例如，pET表达载体适用于表达具有标签的蛋白，pGEX表达载体适用于表达具有谷氨酸-S-转移酶标签的蛋白，pMAL表达载体适用于表达具有麦芽糖结合蛋白标签的蛋白。

在进行目的蛋白的原核表达时，还需要考虑到表达条件的优化。例如，可以通过调节温度、添加诱导剂等方式来提高表达效率。此外，还可以通过改变培养基成分、添加辅助蛋白等方式来优化表达效果。

目的蛋白的原核表达是一种高效、简便、成本低的蛋白质表达方式。在进行目的蛋白的原核表达时，需要选择合适的表达载体、优化表达条件，以提高表达效率和表达质量。这种表达方式在生物医学研究、工业生产等领域具有广泛的应用前景。

真核基因在大肠杆菌中的表达形式

大肠杆菌被内膜和外膜隔成3个腔：胞内、周质和胞外，表达的蛋白定位于这3个腔内。真核基因在大肠杆菌的表达形式根据表达产物的定位一般可分为两类：胞内表达和蛋白分泌表达。胞内表达是最主要的表达形式，表达产物以可溶性蛋白和/或不溶性的包涵体形式存在于大肠杆菌细胞内。而根据表达产物本身的性质又分为融合表达和非融合表达。

一、胞内表达

1、非融合表达

非融合表达即直接表达天然蛋白，所表达的真核生物蛋白肽链的N端不含有任何原核肽段。真核基因通常缺乏能被原核生物的转录和翻译系统识别的序列，包括启动子、有效地核糖体结合位点，有时还缺乏ATG起始密码子和转录终止子，因此必须插入带有这些调控序列的表达载体方能表达。

有时，非融合表达不能产生目的蛋白，尤其是目的蛋白的氨基酸含有甲硫氨酸时。由于甲硫氨酸是由ATG编码的，在大肠杆菌中，氨基端的甲硫氨酸会被不同程度地去除。此外，非融合蛋白易被宿主蛋白酶破坏，产生无活性的蛋白，这是影响表达效率的重要因素。克服的方法有：①采用Ion-营养缺陷型宿主。大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖于黄嘌呤核苷（Ion），用Ion-宿主，使蛋白酶不能合成，从而保护真核蛋白；②克隆Pin基因。T4噬菌体Pin基因产物为细菌蛋白酶抑制剂，将Pin基因克隆到质粒上，并转化大肠杆菌，可保护真核蛋白。

2、融合表达

融合表达即表达的真核蛋白肽链N端含原核生物肽段，融合表达的方法是将真核基因插入启动子后已证实能高效表达的原核结构基因的下游，以产生融合蛋白的方式表达目的基因。由于融合基因5'端为表达载体中的原核基因序列，已优化的翻译起始区的二级结构不受插入外源基因的干扰，因此，融合表达的效率高。需要注意的是，插入基因的转录方向和阅读框架必须与原核片段的阅读框架相吻合，不能产生移码，否则不能表达。

融合蛋白需经处理后方能释放出真核蛋白，常用的后处理方法有溴化氰和蛋白酶裂解，这就要求融合蛋白在其原核肽段与目的蛋白间应含有能被溴化氰和蛋白酶裂解的序列，而且目的蛋白内部不能含有溴化氰和蛋白酶切割位点。溴化氰能切割蛋氨酸残基后的肽键；牛凝血因子X用Russel蝰蛇毒液活化成因子Xa后，能在四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg中的精氨酸（Arg）后特异地切割肽链；凝血酶（thrombin）也能识别和切割特定的肽序列，这些识别序列通常都已构建于融合表达载体中。