组织化学技术5免疫组化

１２４　包头医学院学报　第２６卷　取、灌胃技术、性别鉴定、染色标记、断颈椎处死等，并　把这５项基本技能作为实验考试的内容。训练中以小　鼠为实验对象，训练学生如何正确抓取动物，要求每个　学生必须独立、正规、准确的操作。对于少部分对实验　动物有畏惧心理的学生，授课教师耐心反复地讲解和　示范，使学生克服胆怯心理；通过多看多练、循序渐进，　使每个学生掌握最基本的技能，在这个基础上，各种染　毒方法、取材方法都能很好地被学生掌握，使实验课的　基本技ｆｉ￣ｉＪ　ａｌ练达到预期目的。　教学内容、教学方式的改革是一个任重道远的过　程，也是一个循序渐进的过程。以创新思维带动多角　度、多层次的教学，不断探索教与学中的新方法，建设　素质过硬、结构合理的师资队伍，将对培养合格的预防　医学毕业生和未来的毒理学专业人才打下坚实的基　础。　参考文献　［１］王心如．毒理学实验方法与技术［Ｍ］．２版．北京：人民卫　生出版社，２００７：１—２．　［２］　栾加双，王亚君．绪论教学在大学授课过程中的重要性探　讨［Ｊ］．职业教育，２００８，１０（１２９）：５７—５８．　［３］葛友华，袁健．课堂教学手段合理运用的探索［Ｊ］．黑龙江　教育（高教研究与评估），２００７，（７—８）：１３６—１３７．　（收稿日期：２０１０－１０－０９）　免疫组织化学技术标准化及常见问题的处理　黄世琪宋芳郝奋韩秀雁　（包头医学院组织学与胚胎学教研室，内蒙古包头０１４０６０）　随着单克隆抗体技术的迅速发展，免疫组织化学　染色已成为广泛应用的实验手段，尽管其理论很简单，　但在实际操作中还存在着许多有待商讨的问题，诸多　因素可以影响免疫组化的染色结果，因此将免疫组化　技术标准化成为目前的焦点。　１免疫组织化学标准化的染色方法　１．１染色前的处理正确的取材、脱水、浸蜡十分重　要，组织材料处理是获得良好结果的前提，必须保证要　检测的细胞或组织取材新鲜、固定及时，形态保存良　好。目前许多实验室公认组织脱片的原因之一是取材　过厚以及脱水、浸蜡处理不当所致，理想的取材厚度是　２　ｃｍ。　要针对组织渗透性及保持组织结构的完整性和抗　原活性选择固定液，目前，首选的固定液仍是ｌＯ％中　性福尔马林，但固定时间不易过长。福尔马林固定引　起组织抗原决定簇的封闭与交联可以通过抗原修复的　方法来修正　】，但我们根据经验认为采用Ｂｏｕｉｎ固定　液可以避免交联键的形成，对于新鲜组织可不做抗原　修复。　由于在免疫组化操作过程中极易出现脱片现象，　为保证实验的顺利进行，一般需采用黏附剂对已清洗　的载玻片进行处理，常用的有ＡＰＥＳ、Ｐｏｌｙ—Ｌ—Ｌｙｓｉｎ、　Ｈｉｓｔｏｇｒｉｐ　。Ｍ等。切片的厚度应在４～５　ｍ，过厚的切片　不仅容易脱片，还影响免疫反应和观察效果。高温烤　片对抗原有破坏，我们建议５Ｏ℃左右烤片过夜，既保　持了抗原活性又避免了脱片现象的发生。切片的脱蜡　步骤与常规ＨＥ染色的脱蜡步骤相同，但免疫组化要　求脱蜡彻底、干净，因此最好与常规ＨＥ脱蜡分开，以　达到更好的染色效果。　１．２染色　１．２．１　内源性过氧化物酶的灭活　如果采用过氧化　物酶检测系统，则必须对内源性过氧化物酶进行封闭　处理，一般用３％Ｈ：Ｏ　，对染色结果和组织细胞的抗　原性均无明显影响。　１．２．２抗原修复　目前所进行的常规石蜡切片均用　甲醛固定，由于形成醛键或蛋白之间发生交联而使抗　原决定簇隐蔽，因此有些抗原需要先进行抗原修复或　暴露。常用的有酶消化法和加热抗原两种修复方法。　酶消化法是最早的抗原修复方法，常用的酶有：胰蛋白　酶、胃蛋白酶等，现已很少应用，只有少数的抗体可以　选择酶消化法。加热抗原修复法是１９９１年Ｓｈｉ等　报道的，处理后使免疫组化染色的敏感度大大提高，其　机制还不十分清楚，推测可能是加热打开了组织抗原　因福尔马林固定引起的抗原决定簇的交联。常用的加　热方法有水浴法、微波法和高压法，高压法优于其它两　种方法。加热抗原修复液有柠檬酸盐缓冲液、ｒｉｆｆｓ、　ＥＤＴＡ等，目前首选柠檬酸盐缓冲液，其优点是染色背　景清晰，适合于大多数抗体，

一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标 记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位 检测技术。目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。

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（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）

SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:

SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理 采用生物素标记的第 二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞 和组织中的抗原。

主要步骤 :

主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯 II

5~10min 一无水乙醇 5min 一95%乙醇 5min 一80%乙醇 5min 一70%乙醇

5min 一自来水洗

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2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS

洗3次，每次5min。3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）

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5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育 30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。

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7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。

8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜 下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。

染色步骤 :

染色步骤 石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物

山西医药杂志２０１０年１１月第３９卷第１１期下半月　Ｓｈａｎｘｉ　Ｍｅ　，　！！　！！　！　！：　！！　：　！　！兰！！　

免疫组织化学技术的标准化质量控制　

山西省人民医院（０３００１２）　赵丽平　杨莉珠　

免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理，对组织　切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位　

研究的一种技术。免疫组织化学是用标记物或显色物标记　

的抗体寻找组织细胞中的的抗原，来检测组织细胞中化学　

成分从而达到诊断和研究疾病的目的。免疫组织化学实验　

步骤多，影响因素复杂，因此免疫组织化学的质量控制显得　

尤其重要。本文对免疫组织化学技术的标准化质量控制进　

行了探索，现介绍如下。　

１标本的固定　１．１　为了使细胞和组织保持原有的形态结构，防止组织自　

溶、抗原物质的抗原性不丢失。不同抗原其稳定性也不同，　

因此固定是质控的关键。标本离体后要求在１５　ｍｉｎ内用　

１Ｏ　甲醛固定，时间为１２～２４　ｈ，最好不要超过７２　ｈ。相　

对恒定的标本固定时间是保证高质量免疫组织化学的关　

键。因为组织固定时间过长，切片中容易产生甲醛色素颗　

粒，影响结果观察及抗原不可逆性破坏无法修复而产生阴　

性表达。组织固定时问不足会造成抗原丢失，组织表面抗　

原阳性表达而中央为阴性表达。固定液的种类很多，不同　

的抗原和标本经过反复试验选用最佳固定液。　

ｌ＿２　固定组织固定液的用量为标本体积的５～１Ｏ倍。标　

本过大时应切开，这样才能固定充分。固定液的浓度过高、　过低都会因组织固定差而导致抗原丢失或出现非特异性背　

景染色。固定液应由制剂室统一配置这样才能保证固定液　

的浓度，确保免疫组织化学结果的可靠信。我院接诊的下　

级医院的会诊标本常常出现所有抗体全部阴性。主要原因　

是固定液的浓度以及固定液种类不符合要求。　

２切片、烤片　

免疫组织化学染色切片厚度应要求在２～３　ｍ，以利　

于观察。太厚影响染色结果和诊断。且免疫组织化学实验　

步骤多，易出现脱片现象，需将载玻片处理。处理方法：先　

免疫组织化学技术

免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。

概述

免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。

免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。

标本的处理

标本的主要来源

标本的来源主要有以下几种：

1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。

2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。

3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。

标本的固定与保存

使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；

保存组织细胞抗原性；

防止标本脱落；

除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；

抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。

蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；

微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；

多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；

去除黏液物质：透明质酸酶等；

去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。

冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。

石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。

抗原的保存与修复

使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。常用方法有：

1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。