制作琼脂糖凝胶的步骤

琼脂糖温敏水凝胶

琼脂糖温敏水凝胶是一种具有温敏性质的水凝胶，凝胶形成和溶胀都受温度影响，可以广泛应用于生物医学领域、食品工业、环保和化工等领域。以下将分别介绍琼脂糖温敏水凝胶的定义、性质、制备方法以及应用领域。

一、定义

琼脂糖温敏水凝胶是一种由琼脂糖、丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺等组分构成的水性高分子材料。它具有温敏性质，在一定温度范围内可进行溶胀和凝胶化。该水凝胶具有许多优良性质，如高生物相容性、生物降解性、温度响应性和可控性等。

二、性质

1. 温敏性

琼脂糖温敏水凝胶的温敏性是其最显著的性质之一，它可以通过温度的变化来改变溶解度和凝胶化性质。在低温下，它可以溶解于水中形成均一溶液，而在高温下，它会形成凝胶，这是由于高温下受热聚合，结构趋于紧密而使胶体颗粒聚集所致。

2. 生物相容性

由于琼脂糖温敏水凝胶的组成成分与大部分生物体组织成分相似，因此具有较高的生物相容性。在医学领域中，琼脂糖温敏水凝胶用于制备磷酸钙、羟基磷灰石等人工骨材料。

3. 可控性

制备方法和温度等因素对琼脂糖温敏水凝胶的性能有着很大的影响，可以通过调节这些因素来控制凝胶的性质，例如，凝胶化的速率、水吸附性能和稳定性等。

三、制备方法

琼脂糖温敏水凝胶的制备是一种简单的自由基聚合反应，具体步骤如下：

1. 以琼脂糖为主要水溶性单体，加入丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺等交联剂，混合均匀。

2. 加入过氧化氢等自由基引发剂，在低温下进行溶液聚合反应。

3. 调节温度，使反应体系中的数值达到临界值，水凝胶即可形成。

四、应用领域

1. 医学领域。琼脂糖温敏水凝胶可以制备出生物相容性高、生物降解性的人工骨材料、人工血管补片等，在组织工程和再生医学方面具有广阔的应用前景。

2. 食品工业。琼脂糖温敏水凝胶在食品加工中也有很广泛的应用，例如，制作果冻、布丁等充填料及保持剂等。

3. 环保和化工。琼脂糖温敏水凝胶可以应用于吸附和去除污染物质，例如，用其作为某些化学物质的载体，可以有效去除有机氯、有机溶剂和重金属等。

制胶（2%琼脂糖凝胶）操作流程：

物品准备：琼脂糖，0.5×TBE，制胶板，三角烧瓶，加样器，量筒。

1. 当制胶板完全干燥时，在开口的两边贴好透明胶封口。如制胶板刚洗干净，需使用干净纱布将水擦干，再放置15分钟以上，等完全干燥后再贴透明胶。

2. 称取7g琼脂糖粉（agarose），加入锥形瓶中。

3. 在锥形瓶中加350 ml 0.5×TBE 电泳缓冲液。

4. 将锥形瓶放入微波炉中加热至白色颗粒完全溶解，呈透明状。（先开中高火4min，再根据情况加热到沸腾，约要反复沸腾3-4次）（一定要完全溶解至完全透明！！）

5. 将锥形瓶取出（勿烫伤），稍降温，加入20-25l Glodview，轻轻摇匀，静置至无大量气泡（推荐加入20l Glodview）。

6. 将锥形瓶内液体缓慢倒入槽内，避免产生气泡，观察是否漏胶，等无大量水蒸汽时，上好梳子。

7. 待凝胶凝固后（大约30min），将梳子拔出，（取梳子时一定要两边用力平衡，动作要轻）。

8. 使用手术刀片将凝胶切割成条状，将暂时不用的胶块用保鲜膜包好存放。如存放时间可能超过1星期，可适当在保鲜膜里面加一点水。

9. 使用自来水小心、完全地清洗制胶板，然后竖直放于实验台上晾干。

点样：

1. 先将电泳槽两端的电泳液充分混匀。当电泳缓冲液由于蒸发减少时，加去离子水补齐，然后再混匀。

2. 当电泳液使用一星期或者较多次数时，请将电泳液倒掉，使用自来水及洗洁精仔细清洗电泳槽。注意不能使用硬物洗涤，最好只使用流水将污染物洗掉。

3. 将制好的凝胶胶放入电泳槽内，使其完全浸入电泳缓冲液中。

4. 打开PCR样品盖，每个样品管中加入5 l 6＊Loading Buffer。

5. 用排枪吹打样品2-3次，使其与loading buffer充分混合，小心吸出，点到相应的孔中，对应好孔号与样品号，在留出的孔中点上Marker 5ul。点样时，小心的左右移动点样枪头，使样品均匀的铺在整个点样孔底。

琼脂糖凝胶成胶的原理

琼脂糖凝胶是一种水溶性的多糖，由于其特殊的物理性质而被广泛应用于生物学实验和制药工业中。琼脂糖凝胶的成胶原理与其分子结构有关，主要包括琼脂糖的高分子量、支链以及琼脂糖与水的相互作用等因素。

琼脂糖的高分子量是琼脂糖凝胶成胶的关键因素之一。通常情况下，琼脂糖的分子量较高，其中每个分子链上含有大量的单糖单元。这些单糖单元之间通过共价键或非共价键相连，形成了一个复杂的网络结构。当琼脂糖溶解在水中时，分子链会不断地扩展和交叉，形成一个大的分子网络。这个网络结构能够捕获水分子，并通过水分子间的氢键与之相连，从而形成胶体凝胶的结构。

此外，琼脂糖的支链也对成胶起到了重要的作用。支链的引入可以增加凝胶的稳定性和强度。琼脂糖凝胶通常是通过在琼脂糖分子上引入支链，来调节凝胶的特性。支链的引入会增加琼脂糖分子的体积，使得分子间的相互作用增强，从而增加凝胶的坚固性。

除了分子结构，琼脂糖与水的相互作用也对凝胶的形成起到了重要的作用。琼脂糖是一种亲水性高的多糖，在水中溶解时，会与水分子形成氢键和范德华力等多种相互作用。这些相互作用能够使琼脂糖分子在水中形成稳定的结构，从而形成凝胶。

琼脂糖凝胶的形成过程可以分为两个阶段：溶胶到凝胶的过渡和持续的凝胶形成。

在溶胶到凝胶的过渡阶段，琼脂糖分子在水中随着温度的升高或浓度的增加，开始逐渐聚集形成小颗粒。这些小颗粒通过相互作用逐渐增大并形成三维网络结构，形成了凝胶阶段。这个过程可以通过琼脂糖溶液的流变学性质来观察到，当琼脂糖溶液的黏度发生明显变化时，可以说明凝胶的形成已经开始。

在持续的凝胶形成阶段，琼脂糖分子继续聚集和形成网络结构，凝胶的稳定性和强度逐渐增加。这个过程主要由分子间的相互作用和水分子的参与来推动。分子间的相互作用可以通过琼脂糖之间的共价键、氢键等相互作用来实现，而水分子则通过与琼脂糖形成氢键来参与凝胶的形成。

总之，琼脂糖凝胶成胶的原理主要包括琼脂糖分子的高分子量、支链以及琼脂糖与水的相互作用等因素。这些因素共同作用，通过形成复杂的分子网络结构，使琼脂糖在水中形成了胶体凝胶。琼脂糖凝胶广泛应用于生物学实验和制药工业中，具有良好的生物相容性和可调节性，对细胞和生物分子的保护和分离起到了重要的作用。

琼脂糖凝胶电泳知识：

琼脂糖凝胶浓度（%） 线状DNA分子分离范围（kb）

0.3 5--60

0.6 1--20

0.9 0.5--7

1.2 0.4--6

1.5 0.2--3

2.0 0.1--2

试剂及配制：

50×TAE缓冲液:2 mol/L Tris-乙酸, 0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)。 配制1000 ml 50×TAE缓冲液方法：Tris 242 g， 冰乙酸 57.1 ml，0.5 mol/L EDTA 100 ml，加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.调pH 8.0，高温高压灭菌,4℃保存.

1×TAE缓冲液的配制:量取20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水.

5×TBE缓冲液（Tris-硼酸）: 配制1000 ml 5×TBE缓冲液方法：Tris 54 g，27.5g硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH

8.0)。加去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.调pH 8.0，高温高压灭菌,4℃保存.

溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶。配制100 ml溴化乙啶贮存液方法：称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.。

6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油（或40%蔗糖）。配制10 ml 6×上样缓冲液方法：溴酚蓝

25 mg

二甲苯青FF 25 mg，甘油 3 ml，用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20℃保存.

琼脂糖凝胶电泳操作步骤：1). 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.