第四章免疫分析技术
免疫分析技术是一种以生物学的免疫反应为基础，利用抗原与抗体的特异性结合来检测、定量和分析特定分子的方法。免疫分析技术广泛应用于医学、生物学、农业、环境科学等领域，成为重要的实验室技术之一、本章将介绍几种免疫分析技术的原理和应用。
1. 免疫沉淀技术（Immunoprecipitation）
免疫沉淀技术是利用抗体与抗原之间的特异性结合，将目标分子从复杂的混合物中沉淀下来。该技术常用于分离、纯化和检测特定的蛋白质或其他生物分子。免疫沉淀技术可以结合其他分析方法，如免疫印迹（Western blotting）或质谱分析，实现目标分子的定性和定量分析。
2. 免疫层析技术（Immunochromatography）
免疫层析技术是一种简单、快速且易于操作的免疫分析方法。该技术基于抗原与抗体之间的特异性结合，利用免疫层析柱或免疫层析纸将目标分子与其他分子分离。例如，免疫层析技术可以用于临床诊断中的快速化验，如妊娠检测、HIV感染检测等。
3. 免疫荧光技术（Immunofluorescence）
免疫荧光技术是一种通过利用荧光染料标记的抗体来检测目标分子的技术。该技术可以在细胞、组织或组织切片中可视化目标分子的分布和定位。免疫荧光技术广泛应用于生物学研究和医学诊断中，如免疫组织化学和细胞分析等。
4. 免疫酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,
ELISA） ELISA是一种常用的免疫分析方法，可提供定性和定量的分析结果。ELISA基于抗原与抗体之间的特异性结合，利用酶标记的二抗或底物发生化学反应，产生可测量的信号。ELISA可以用于检测疾病标志物、药物残留物、激素和分子相互作用等。
免疫分析技术的应用非常广泛。在医学领域，免疫分析技术可用于疾病的早期诊断、治疗监测和预后评估等。在生物学研究中，免疫分析技术可以帮助研究者了解生物分子的结构、功能和相互作用。在农业领域，免疫分析技术可用于检测农作物病害、检测动物疫情和监测环境中的污染物等。此外，免疫分析技术还可应用于食品安全检测、工业生产监控和新药开发等领域。
免疫分析技术和相关仪器
4.1．酶免疫分析仪
4.1.1酶免疫分析技术的分类
酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA) 是目前临床应用最多的一类免疫分析技术，可分为非均相(或异相)酶免疫测定和均相酶免疫测定两种方法。
均相酶免疫分析法（homogeneous enzyme immunoassay，HEI） 均相酶免疫分析主要有酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定两种方法。
非均相酶免疫分析法（heterogeneous enzyme immunoassay）
常用的酶免疫分析法多为非均相法，又可分为液相酶免疫法和固相酶免疫法两种，以后者最常用，称为酶联免疫吸附测定（enzyme
linked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA是临床上最常用的免疫分析方法，目前常用的酶免疫分析仪都是基于ELISA技术，称为酶免疫分析仪。
4.1.2酶免疫分析仪的类型、工作原理及基本结构
根据仪器结构和自动化程度, 针对固相支持物的不同（如微孔板、试管、小珠、磁微粒等）作为吸附免疫试剂的载体，因而设计成不同的酶免疫分析仪，其基本工作原理就是分光光度法，在光电比色计或分光光度计的基础上根据ELISA技术的特点而设计。包括：
微孔板固相酶免疫测定仪器 国际上微孔板式ELISA使用的载体为96孔板，采用直接对微板孔测定吸光度（A）的比色计。
(1) 酶标仪
酶标仪也称为ELISA测读仪（ELISA reader）,有单通道和多通道两种类型。自动型多通道酶标仪有多个光束和多个光电检测器，检测速度快。如8通道的仪器，设有8条光束（或8个光源）、8个检测器和8个放大器。多通道酶标仪的检测速度较快。
酶标仪的工作原理与主要结构和光电比色计几乎完全相同（见图16-1）。既可以使用和分光光度计相同的单色器，也可以使用干涉滤光片来获单色光，此时将滤光片置于微孔板的前、后的效果是一样的。
酶免疫技术
（一）单项选择题（A型题）
1、HRP的活性基团是
A．糖蛋白 B．亚铁血红素 C．白蛋白
D．球蛋白 E．色氨酸
2、表示HRP纯度（RZ）的是
A．入403nm/入275nm B．入420nm/入275nm C．入403nm/入290nm
D．入275nm/入403nm E．入290nm/入275nm
3、HRP（用于标记）的RZ值应大于
A．3.0 B．3.1 C．3.2
D．3.3 E．3.4
4、β-Gal的常用底物是
A．OPD B．TMB C．5-ASA
D．ABTS E．4MUG
5、下列酶-底物-颜色反应组合中，正确的是
A．HRP—OPD—蓝色 B．HRP—TMB—红色 C．AP—P—NPP—黄色
D．HRP—P—NPP—蓝色 E．AP—TMB—蓝色
6、AMIT测定可以测定
A．大分子抗原 B．小分子抗原或半抗原 C．补体
D．PcAb E．McAb
7、应用最广泛的均相EIA是
A．CEDIA B．SPEIA C．AMIT
D．ELISA E．IFA
8、关于酶免疫技术的特噗，正确的是
A．酶标记物催化抗原反应，使其结果放大，提高了检测的灵敏度
B．酶活性易受理化因素的影响，酶标记物稳定性差
C．底物以酶催化后的成色，使酶标主免疫反应结果得以放大
D．选择高度质量的标记用酶是建立酶免疫技术最重要的前提
E．酶免疫技术检测方法较为繁琐
9、关于固相化抗体的制备，正确是的
A．抗体包被固相载体后，再用小牛血清蛋白包被一次为了稳寄存载体对抗体的吸附
B．化学偶联包被抗体，可有效提高包被抗体的结合量．均一性和牢固程度
C．为提高抗体的包被量，包被液的浓度应较高
D．吸附法包被抗体时，选用偏酸性的缓冲液，可提高包被抗体的稳定性
E．包被抗体时，温度越高越有利于提高包被抗体的稳定性
10、关于载体的选择，正确的是
A．醋酸纤维膜吸附蛋白的能力强于塑料板，但对微量样品的吸附不完全
62 食品安全导刊 2017年8月Technology科技分析与检测
在长期农业生产过程中，农药滥用及不合理使用问题，不仅导致出现严重的生态环境问题，还造成农药残留导致的食品安全问题成为社会突出问题。农药残留对人体产生的毒性作用，不仅会影响生理活性酶功能，还会对人体系统功能产生潜在危害，甚至会导致人体的免疫功能降低，从而出现致癌、致畸、致突变[1]。食品中出现的农药残留，除了以往使用的GC-MS及GC等方法外，免疫学技术近年来也获得了深入发展，其中应用最为广泛的就是以固相载体吸附抗原或抗体为基础的酶联免疫分析技术。1 ELISA原理ELISA原理是将特异抗原-抗体免疫学反应与酶学催化反应进行结合，以酶促反应所具有的放大作用来显示初级免疫反应。ELISA是通过合适的载体，酶标固相抗原与未知抗原竞争限定量标记抗体结合位点，从而形成一种抗体复合物。在底物参与下，复合物上长的酶催化底物被水解或氧化还原为另一种物质[2]。由于酶所具有的讲解底物与显色关系呈正比，通过肉眼可以观察，进而确定其是否存在未知抗原或未知含量。2 ELISA在农药残留检测中应用的技术要点2.1 半抗原的设计多数农药都是小分子物质，本身不对机体产生刺激，并不产生针对农药抗原决定簇的特异性，需与大分子载体产生藕联后才能对机体产生刺激，进而产生抗体。因此，需要合成可与载体藕联，并能最大程度地对待测分析结构进行模拟的半抗原。有学者认为，理想的半抗原应包括待测物特征结构、便于机体对特征结构进行识别的连接臂及末端可与蛋白载体产生共价连接的功能基团[3]。因此，半抗原设计原则为尽可能保留待测物特征结构，并在恰当位置引入合适连接臂及功能基团，方便其与大分子载体进行藕联。这时他们还强调连接臂的位置、性质及长度、末端功能的半抗原合成体。连接臂长度为3～5个碳，若连接臂太短，则容易导致载体空间位阻对免疫系统识别产生影响，且半抗原立体机构也容易导致载体局部化学环境的影响而出现变化；若太长，则可能导致半抗原出现折叠臂。一般可以引入非极性连接臂的使用，特殊情况下也可以使用极性连接臂。功能基团可以在引入连接臂时带入，进而对待测物结构直接进行修饰进而产生。2.2 载体选择有无蛋白质具有较复杂的结构，且蛋白质免疫原较好，不仅可以增加半抗原的分子量，而且也可以利用半抗原的强免疫原性诱导免疫应答，从而对半抗原产生一定的载体效应。因此，一般选择蛋白质作为载体。常见的载体一般有牛血清白蛋白、鸡蛋清白蛋白、钥孔血蓝蛋白等。由于牛血清白蛋白物化性质较为稳定，很难出现变性，且价格较低，其在含有有机溶剂的情况下，就可以和半抗原进行藕联，藕联后也可以保持可溶状态。因此，运用较为广泛。2.3 人工抗原及酶标农药抗原合成若农药分子中不具备连续的反应基团，农药分子就需要先经过衍生后再利用连接物与载体蛋白连接。农药衍生不能使半抗原分子出现明显改变，不然抗原性就会发生变化。若半抗原存在反应功能团，就能依据实际情况适当采用双功能交联试剂与方法，使半抗原得以与载体藕联。如羧基半抗原，一般会利用混合酸酐法或二亚胺法进行。另外，藕联反应不应在高温、低温或强酸、强碱的条件下进行，且藕联物的浓度及理化特性等都将会影响藕联效果。3 ELISA在食品检验中的应用一般来说，这种技术在食品检验中应用主要体现在三个方面：在动物性食品检验中应用、在植物性食品检验中应用以及在病原微生物及生物毒素检验中应用。在动物性食品检验中的应用来说，主要体现在以下几个方面：①在兽药残留及违禁药品检验中的效果突出。②在水产品检验中的应用。由于水产品本身就是动物性食品中的重要组成，且许多水产品自带毒性。因此，水产品的食品安全一直是困扰水产业发展的难题。酶联免疫吸附技术在水产品检验中发挥了重要作用，并且解决了许多水产品安全问题。在植物性食品检测中的应用来说，由于植物性食品安全问题主要表现在农药残留后进入食品的微量农药及有毒代谢物等。而酶联免疫吸附技术可以应用数十种农药酶免疫试剂盒，检测有机磷、硫化氨基甲酸脂类等残留农药。4 结语用于食品分析检验的酶联免疫吸附技术应用明显，符合食品检验的准确、快速及易操作等要求，可以在社会食品检测工作中应用。参考文献[1]杨萍.酶联免疫吸附技术分析及其在食品安全检测中的应用[J].科技创业家,2013(21):219.[2]张国范.酶联免疫分析法在食品农药残留检测中的应用[J].中国医药指南,2013(28):595-596.[3]程育春.化学发光免疫分析技术和酶联免疫吸附试验在乙肝病毒血清学检验中的应用[J].中国实用医药,2016(15):53-55.作者简介：赵光远（1986—），男，内蒙古赤峰人，硕士研究生，工程师。研究方向：食品药品检验检测。酶联免疫分析技术在食品检验中的应用□ 赵光远 包头市食品药品检验检测中心摘 要：现如今，食品安全问题已经成为人们关注的重点话题。近年来，由于在各种原因的共同作用下，导致各种食品质量安全问题经常发生，甚至出现了食品中毒情况，从中可见食品安全问题对人及食品业产生的影响是巨大的。酶联免疫分析技术（ELISA）可以在食品微生物、食品毒素及残留农药及转基因食品检验中应用，且应用前景广泛。本文主要探讨了酶联免疫分析技术在食品检验中的应用，以期保证今后的食品安全。关键词：酶联免疫技术；食品检验；ELISA原理DOI:10.16043/ki.cfs.2017.24.047
