酶免疫技术——精选推荐

酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一 种免

疫检测技术。它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保 留了抗体

或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。在酶标抗体 (抗原）与抗原（抗

体）的特异性反应完成后，加人酶的相应底物，通过酶对底物 的显色反应，对抗原或抗

体进行定位、定性或定量的测定分析。它通过利用酶催化 底物反应的生物放大作用，提

高了抗原抗体反应的敏感性。在经典的三大标记技术 中，它具有检测灵敏度高、特异性

强、准确性好、酶标记试剂能够较长时间保持稳 定、操作简便、对环境没有污染等优点，

而且容易与其他技术偶联衍生出适用范围 更广的新方法。

一、酶和酶作用底物

(-)酶的要求 一个酶蛋白分子每分钟可催化103〜104个底物分子转变成有色产物，用酶标记 抗体

或抗原建立酶免疫测定法，可使免疫反应的结果得以放大，保证测定方法的灵敏 度，为

此用于标记的酶应符合下列要求： 1. 酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。 2. 易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的 免

疫反应性。 3. 作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存 在

与标记酶相同的内源性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标 抗原

结合后，酶活性可出现抑制或激活。 4. 酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。 5. 酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物 应

价廉易得。 (二）常用的酶 1-辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP) HRP来源于蔬菜植物辣 根中，分

子量40kD，是由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成的 复合物。辅基

是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶则与酶活性无关， 最大吸收峰在275

nm。HRP的纯度用RZ (Reinheit Zahl,纯度数）表示，它是以 HRP分别在403nm和275nm处

的吸光度比值来表示的。用于酶免疫技术的HRP， 其RZ值应大于3.0。RZ值仅说明血红

素基团在HRP中的含量，并非表示HRp制 剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶

活性也高，RZ值与酶活性无关。 酶活性以单位U表示：即lmin将l^mol底物转化为产物所

需的酶量。酶变性后， RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更

为重要。

HRP是目前在酶联免疫吸附实验（ELISA)中应用最为广泛的标记用酶，主要 是因为其一方面易于提取，价格相对低廉；另一方面性质稳定，耐热，与抗原或抗体

偶联后活性很少受损失。 2. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，Ap) AP是一种憐酸脂

水解酶，可以从 大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但两种来源的AP理化性质有所不同：菌源

性AP分子 量80kD，酶作用最适pH为8.0;肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9. 6;后 一

种AP的活性高于前者。AP用于ELISA必须注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活 性的抑制

作用，因为在EUSA中所使用的温育和洗涤缓冲液一般均为磷酸盐缓冲液 (PBS),含有相对

高浓度的磷离子（15mmol/L)，对碱性磷酸酶有很强的抑制作用， 尽管最后显色反应的底

物在另一种缓冲液中，但前面PBS洗板所残留的PBS足以抑 制约一半的酶活性，因此如试

剂盒标记用酶为碱性磷酸酶，则温育和洗涤缓冲液不能 使用PBS溶液。

在ELISA中应用AP系统，其敏度性一般高于应用HRP系统，空白值也较低， 但由于

AP较难获得高纯度制剂，.稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合 物时得率较HRP

低等原因，故国内在ELISA中的应用不如HRP普及。 3. (3-半乳糖苷酶（|3-galactosidase，卩-Gal)卩-Gal来源于大肠埃希菌，分子量 5

40kD,最适pH 6〜8。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到 内源性

酶的干扰，从而提高特异性被用于均相酶免疫测定中。 (三）常用的底物

1. HRP的底物HRP催化的反应式为：DH2 + H202—D+2H20。式中供氢体 DH2习惯上

被称为底物，H202 (过氧化氢）为受氢体。HRP对受氢体的专一性很 高，除h2o2外，仅作

用于小分子醇过氧化物和尿素过氧化物。而作为供氢体的底物 化合物较多，常用的有以

下几种：

(1) 邻苯二胺（orthophenylenediamino，OPD) ： OPD 被认为是 HRP 最为敏感 的

色原底物之一。OPD在HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫酸或盐酸终止反应后 呈棕黄

色，最大吸收峰在492nm波长。OPD是ELISA中应用最早的底物，但其应 用液稳定性差，

易变色，需新配制后在1小时内使用，显色反应过程需避光，而且具 有致癌性。由于OPD

的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供 应，临用时再溶解于相应的

缓冲液中。

(2) 四甲基联苯胺（3，3'，5, S^tetramethylbenzidine, TMB) ： TMB 是一种优 于OPD的新型HRP色原底物。TMB经HRP作用后变为蓝色，加人

硫酸终止反应 后变为黄色，最大吸收峰波长为450nm。TMB具有稳定性好，'成色无需避

光，无致 突变作用等优点，已成为目前ELISA中应用最广泛的底物。缺点是水溶性差。 在商品ELISA试剂盒尤其是国内的产品中，TMB色原底物常为配好的A和B 两种液态

试剂，其中一种是含一定浓度的过氧化氢的溶液，另一种为TMB溶液，鉴 于过氧化氢、TMB在溶液中相对不稳定的特点，因此在使用ELISA试剂盒时，如发 现底物A和B出现颜

色，或两者各取1滴混合后显色，说明该试剂盒的底物溶液已 变质或已受污染，必须废弃。

(3) 其他：5-氨基水杨酸(5-aminosalicyclic

acid, 5-ASA)和 2，2'-氨基〜二 (3- 乙基-

苯并噻哩啉横酸-6)铵盐〔2，2'-amino-di (3-ethylbenzothiazoline sulphonic acid-6) ammonium salt, ABTS〕也是 HRP 常用的底物。 2. AP 的底物常用对-硝基苯磷酸脂（p-nitrophenyl phosphate, p-NPP) p- NPP经A

P作用后的产物为黄色对硝基酸，最大吸收峰波长为405nm。

3. p-半乳糖苷酶（(B-GaD的底物常用4-甲基伞酮基-(H5半乳糖苷（4-methy- lumb

elliferyl-(B-D-galactoside, 4MUG)，酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮 (4-met

hylumbelliferone, 4MU)，其敏度性较HRP者高30〜50倍，但测量时需用荧 光计。

二、酶标记抗体或抗原

酶标记抗体或抗原是指通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合 物，

也称酶标志物或酶结合物。酶结合物（conjugate)是酶免疫技术的核心组成部 分。酶结合

物的质量直接影响酶免疫技术的应用效果。酶免疫测定试剂盒的有效使用 期限即是根据

酶结合物的稳定性而定，酶免疫测定试剂盒中，最易受外环境影响的部 分就是酶结合物。！

由此可见酶标志物的制备对于酶免疫技术是非常关键的一个环节。 高质量的酶标抗体或

抗原同酶、抗体或抗原等原材料的特性及制备方法密切相关。 (一）酶标记抗体或抗原的制备

用于制备酶标志物的抗原要求纯度高，抗原性完整（半抗原需先与大分子载体蛋 白

交联）；抗体则不仅需要特异性好、效价高、亲和力强以及比活性较高，而且还需 要能

批量生产和易于分离纯化。目前常根据具体方法要求选用单克隆抗体、多克隆抗 体经纯

化的Ig组分、Ig的Fal/和F (ab,)2片段等。 酶标记抗体或抗原的方法有多种，常因酶不同而用不同的标记方法。标记方法一 般

应符合：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的 活性；

酶标志物稳定，应避免酶、抗体（抗原）以及酶标志物各自形成聚合物等。常 用的标记

方法有交联法和直接法两种。交联法是以双功能交联剂为“桥”，分别与酶 和抗体（抗原）

连接而形成结合物，因此交联剂至少应有两个可与蛋白质分子通过化 学反应而结合的反

应基团，反应基团相同者称为同源双功能交联剂（如戊二醛），不 同者称异源双功能交

联剂（如羟琥珀亚胺酯）。直接法则是用过碘酸钠活化酶蛋白分 子后，再与抗体（抗原）

结合。下面分别介绍两种方法的基本原理。 1. 戊二醛交联法戊二醛为同源双功能交联剂，它有两个相同的醛基，可分别 与酶

分子和抗体（抗原）分子上的氨基结合。戊二醛法又根据试剂加人的方法分为一 步法和

二步法。^•步法是将抗体（抗原）、酶和戊二醛同时反应连接而成。此法操作 简便，广泛

用于HRP、AP与抗体（抗原）的标记。但酶标志物的产率低，酶标志物 易聚合，而且酶

与酶、抗体与抗体之间也可发生交联，影响标志物质量。二步法则是 将过量戊二醛与酶

反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛上的醛基结合，不发生酶与酶 的结合，除去未与酶

结合的多余戊二醛后，再加入抗体（抗原），形成酶-戊二醛-抗 体（抗原）结合物。其

优点是酶标志物质量较均一，标记效率也较一步法高。 2. 改良过碘酸钠法此法是目前用于HRP标记抗体或抗原的最常用方法。过碘 酸钠

可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基，后者与抗体蛋白中的游离氨基结合形 成Schiff碱，再加人硼氢化钠还原后，即生成稳定的酶标志物。为防止酶蛋白分子中

98 ^w-- + 氨基与醛基发生自身偶联反应，标记前需用2，4-二硝基氟苯（2,4-dinitro-fluoro- benzene, DNFB)封闭酶蛋白分子中残存的a-氨基和s-氨基。’此法酶标志物产率 较高。

(二）酶标志物的纯化及鉴定

标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗 原

聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异 性染

色强度，常用的纯化方法有葡聚糖凝胶G -200/G -150过柱层析纯化和50%饱和 硫酸铵沉

淀提纯等。丨 每批制备的酶标志物都要进行质量和标记率的鉴定，质量鉴定包括酶活性和抗体 (抗

原）的免疫活性的鉴定。常用免疫电泳或双相扩散法，出现沉淀线表示酶标志物 中的抗

体（抗原）具有免疫活性。沉淀线经生理盐水反复漂洗后，滴加酶的底物溶 液，若在沉

淀线上能显色，则表示酶标志物中的酶活性仍保留。也可直接用ELISA 方法测定。酶标记

率的测定常用分光光度法分别测定酶标志物中酶和抗体（抗原）蛋 白的含量，再按一定

的公式计算其标记率。

三、固相载体

除均相酶免疫测定外，各种非均相酶免疫测定反应最后都需要分离游离和结合的 酶

标志物。固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面上，是酶免技术 中将

游离和结合的酶标志物迅速分离的最常用方法，因此对固相材料和固相方法的选 择是酶

免疫测定的基础。

(-)固相载体的要求 . 凡具备下述条件的材料均可作为固相载体：结合抗体或抗原的容量大；可将抗体 或

抗原牢固地固定在其表面，经长期保存和多次洗涤也不易脱落；不影响所固定的抗 体或