抑制骨髓间充质干细胞成脂分化能力对骨质疏松

抑制骨髓间充质干细胞成脂分化能力对骨质疏松

目的 探讨抑制骨髓间充质干细胞（BMSCs）成脂分化能力对骨质疏松（OP）的早期疗效。 方法 选取雌性SD大鼠40只，采用背侧入路摘除卵巢法建立大鼠OP模型。随机分为4组：A组（假手术组）、B组（模型组）、C组（BMSCs治疗组）、D组（RNAi转染BMSCs治疗组），每组10只。造模后7 d经尾静脉分别注射生理盐水、10%胎牛血清的LG-DMEM培养液、BMSCs、RNAi转染BMSCs，BMSCs来自课题组从SD大鼠骨髓中提取并经过流式细胞仪和诱导分化染色鉴定的BMSCs，RNAi转染BMSCs来自课题组前一部分体外实验中使用腺病毒转染后的BMSCs。干预后，依照分组行骨密度（BMD）、骨转换标志物检测。比较4组大鼠的骨转换标志物在OP早期骨形成与骨吸收过程中的变化。

结果 D组的BMD显著高于B、C组（P＜0.05），而与A组差异无统计学意义（P>0.05）；D组的PⅠNP高于B、C组（P＜0.05），而与A组差异无统计学意义（P>0.05）；D组的β-CTX低于B、C组（P＜0.05），而与A组差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 RNAi转染BMSCs可提高去势大鼠的BMD，促进骨形成。

[Abstract] Objective To explore the early curative effect of restraining fat

differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） in

osteoporosis （OP）. Methods 40 female SD rats were selected.Osteoporotic of rats

model was established by dorsal approach ovary removal method.Rats were randomly

divided into four groups：group A （sham-operated group），group B （model group），group C （BMSCs treatment group） and group D （RNAi transfection BMSCs

treatment group）.Each group has 10 rats.After 7 days moldeling，rats in four groups

were injected saline，LG-DMEM culture contained 10% fetal bovine serum，BMSCs

and RNAi transfection BMSCs.BMSCs were extracted from SD rat bone marrow of

and identified by flow cytometer and induced differentiation dyeing.RNAi

transfection BMSCs were from the transfected BMSCs of adenovirus used for the

former parts of in vitro experiment in research group.After intervention，bone mineral

density （BMD） and markers of bone turnover were tested according to

grouping.The change of bone turnover markers of rats in bone formation and bone

resorption of the early osteoporosis was compared among four groups. Results BMD

in group D was higher than that of group B and C （P＜0.05），but had no significant

difference compared with group A （P>0.05）.PINP in group D was higher than that of

group B and C （P＜0.05），but had no significant difference compared with group A

（P>0.05）.β-CTX in D group was lower than that of group B and C （P＜0.05），but

had no significant difference compared with group A （P>0.05）. Conclusion RNAi

transfection BMSCs can improve BMD of castration rats and promote bone

formation.[Key words] RNA interference；Bone marrow mesenchymal stem cells；Osteoporosis；Bone mineral density；Procollagen type Ⅰ N-terminal propeptide；β-C-terminal cross-linking telopeptide of typeⅠcollagen

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以低骨量和骨组织微细结构破坏为特征，

导致骨脆性和骨折危险性增加的一种全身骨骼性疾病[1]。在我国，OP患者已经达到2亿以上，占总人数的15%左右，在我国60岁以上的老年人中约30%患有OP[2]，其不仅增加社会负担和经济负担，而且降低生活质量甚至还可能导致残疾。

我们课题组在前期体外实验研究中发现，Evi1基因在骨髓间充质干细胞（BMSCs）向脂肪分化的过程中起决定性作用，通过RNA干扰技术抑制其表达，阻断BMSCs的脂肪分化过程，同时又促进BMSCs的成骨分化。本实验以SD大鼠制备OP模型，观察Evi1基因在动物体内是否存在同样的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

选取健康雌性SD大鼠40只，体重为180～250 g，由北京军事医学科学院实验动物中心提供（批号：SCXK2007-004）。BMSCs来自课题组从SD大鼠骨髓中提取并经过流式细胞仪和诱导分化染色鉴定的BMSCs，RNAi转染BMSCs来自课题组前一部分体外实验中使用腺病毒转染后的BMSCs。Ⅰ型前胶原氨基端前肽（procollagen type Ⅰ N-terminal propeptide，PⅠNP）和β-Ⅰ型胶原羧基端肽（β-C-terminal cross-linking telopeptide of typeⅠcollagen，β-CTx）ELISA试剂盒由上海科敏生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 采用经典的卵巢去势法。以脊柱两侧为入路完整摘除双侧卵巢，结扎输卵管。

1.2.2 动物分组及处理 将雌性SD大鼠随机分为4组：A组（假手术组）、B组（模型组）、C组（BMSCs治疗组）、D组（RNAi转染BMSCs治疗组），每组10只。假手术组仅切除卵巢周围些许脂肪，未摘除卵巢；B、C、D组大鼠均建立OP模型。在去势7 d后，A、B组经尾静脉分别注射1 ml DMEM低糖培养液；C、D组分别注射1 ml BMSCs（1×106）和RNAi转染BMSCs（1×106）。尾静脉注射后28 d采获血液与大鼠双侧股骨标本。

1.2.3 骨密度（bone mineral density，BMD）测定 使用XR-46双能光子骨密度仪测定大鼠右侧股骨标本的BMD。

1.2.4 骨转换生化标志物检测 骨转换生化标志物包括骨形成标志物（PⅠNP）和骨吸收标志物（β-CTx）。分别于干预后28 d，4组大鼠麻醉后，开腹暴露腹主动脉，经腹主动脉采获血液标本，ELISA试剂盒检测Ⅰ型前胶原氨基端前肽和Ⅰ型胶原羧基端肽。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

D、C组的BMD显著高于B组（P＜0.05），而与A组差异无统计学意义（P>0.05）；D组的BMD显著高于C组（P＜0.05）；D、C组的PⅠNP显著高于B组（P＜0.05），而与A组差异无统计学意义（P>0.05），D组的PⅠNP显著高于C组（P＜0.05）；D、C组的β-CTx显著低于B组（P＜0.05），而与A组差异无统计学意义（P>0.05），D组的β-CTx显著低于C组（P＜0.05）（表1）。

表1 4组股骨BMD、PⅠNP、β-CTX的比较（x±s，n=40）

与B组比较，*P＜0.05；与C组比较，#P＜0.05

3 讨论

常用于OP的模型动物有大鼠、小鼠、犬、兔、羊、灵长类动物等[3]。大鼠骨代谢与人有许多相似之处，随年龄增长出现骨量丢失，具有与人相似的骨松质分布及重建功能，卵巢切除后出现较高的骨转化率并对性激素有与人相似的反应性等[4]，雌性大鼠去势导致的骨量丢失和人类绝经后OP有许多相似之处[5]。大鼠成为建立OP模型应用最广的动物。

目前利用双光能X线吸收法（dualenergy X-ray absorptiometry，DXA）测量BMD 是诊断OP的重要手段[6]，因此在本实验开始前已经对4组SD大鼠的双侧股骨使用组织钳钝性分离其软组织，并在测量过程中选了4组大鼠右侧股骨测量BMD并记录其面积（cm2）、骨矿含量（g），最大限度地减少主观因素所带来的误差，以便分析其统计学意义。

本实验结果显示，D、C组的BMD显著高于B组（P＜0.05），而与A组差异无统计学意义（P>0.05），说明RNAi转染BMSCs和BMSCs能够避免大鼠去卵巢后发生骨量丢失现象，且未达到正常骨量。D组的BMD显著高于C组（P＜0.05），提示RNAi转染BMSCs更能减少股骨骨量丢失。

目前，PⅠNP和β-CTx是常见的骨形成及骨吸收标志物[7-8]，骨转换生化标志物检测中，PⅠNP是反映成骨细胞功能状态的直接或间接产物，是鉴定细胞骨向分化的重要标志[9]。本实验中，D、C组的PⅠNP显著高于B组（P＜0.05），而与A组差异无统计学意义（P>0.05），说明RNAi转染BMSCs和BMSCs能够避免大鼠去卵巢后成骨细胞中大量的Ⅰ型前胶原分泌到细胞外，且未达到正常水平。D组的PⅠNP显著高于C组（P＜0.05），说明RNAi转染BMSCs可使大鼠去卵巢后成骨细胞中大量的Ⅰ型前胶原分泌到细胞外水平优于BMSCs。β-CTx是反映骨吸收过程中破骨细胞分泌的骨组织产物。本实验中，D、C组的β-CTx显著低于B组（P＜0.05），而与A组差异无统计学意义（P>0.05），说明RNAi转染BMSCs和BMSCs能够避免大鼠去卵巢后骨吸收过程中骨胶原降解，且未