lncRNA调控间充质干细胞向成骨细胞分化的研究进展

实用医学杂志２００７年第２３卷第ｌ８期　

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向　

诱导分化的实验研究　

朱伟孙俊英岑建龙朱礼贤顾联　

摘要　目的：研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞（ｈＭＳＣｓ）在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞．　探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法：从骨髓血中提取ｈＭＳＣｓ．在含１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养　基中培养，以流式细胞仪检测ｈＭＳＣｓ的表面抗原表达。传代后改用含地塞米松、Ｂ一甘油磷酸钠和维生素ｃ的条件　培养基培养，相差显微镜观察并绘制生长曲线。免疫组化检测Ｉ型胶原、骨钙素。ＮＡＰ法碱性磷酸酶染色、ｙｏｎ　Ｋｏｓｓａ法钙结节染色。结果：ｈＭＳＣｓ增殖活跃，ＣＤ１０５、ＣＤ４４表达阳性，ＣＤ１４、ＣＤ３４和ＣＤ４５阴性。诱导培养后碱性　磷酸酶、钙结节、Ｉ型胶原和骨钙素染色阳性。结论：ｈＭＳＣｓ取材方便．易诱导分化为成骨细胞，是研究骨组织工程　的理想种子细胞。　关键词　间质干细胞骨髓细胞成骨细胞分化组织工程　

Ｓｔｌｌｄｙ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｕｌｔ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏｗａｒｄ　ｏｓｔｅｓｂｌａｓｔｓ／ｎ　ｖｉｔｒｏ　ＺＨＵ　Ｗｅｉ　，ＳＵＮ　Ｊｕｎ．　ｒｉｎｇ，ＣＥＮ　Ｊｉａｎ—ｌｏｎｇ，ＺＨＵ　Ｌｉ—ｘｉａｎ，ＧＵ　Ｌｉａｎ．　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，Ｐｅｏｐｌｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｔａｉｚｈｏｕ，Ｔａｉｚｈｏｕ　２２５３ｏ０．Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｕｌｔ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ｈＭＳＣｓ）ｔｏｗａｒｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｂｅｉｎｇ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ　ｔａｋｅｎ　ａｓ　ｓｅｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｂｏｎｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｈＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ　ｉｎ　ＤＭＥＭ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　１００　ｍＬ／Ｌ　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ．ｈＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｔｈｅ　ｓｕｂｃｕｈｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｂｅｔａ—ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｎｄ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｐｈａｓｅ—ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｗａｓ　ｄｒａｗｎ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈＭＳＣｓ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ＮＡＰ．ｔｈｅ　ｃａｌｃｉｆｉｅｄ　ｎｏｄｕｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｙｏｎ　Ｋｏｓｓａ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｈＭＳＣｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ　ｒａｐｉｄｌｙ　ｉｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｎ　ｖｉｔｒｏ　ｅｘｐａｎｄｅｄ　ｈＭＳＣｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌ　ｍａｒｋｅｒ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ１０５　ａｎｄ　ＣＤ４４，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ１４，　ＣＤ３４　ａｎｄ　ＣＤ４５．ｒＩ１ｈｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　Ｉ，　ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ　ａｎｄ　ｃａｌｃｉｆｉｅｄ　ｎｏｄｕｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ａｆｔｅｒ　ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ｈＭＳＣｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ｄｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｓｉｍｐｌｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｔｈｅ　ｈＭＳＣｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｔａｋｅｎ　ａｓ　ｉｄｅａｌａｎｄ　ｐｅｒｆｅｃｔ　ｓｅｅｄｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｂｏｎｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　Ｂｏｎｅ　ｍａｒｌ＇ｏｗ　ｃｅｌｌｓ　Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　

HainanMedJ,Feb.2013,Vol.24,No.3海南医学2013年2月第24卷第3期

基金项目：广东省科技计划项目（编号：2010B031600288）

通讯作者：魏劲松。E-mail：jlccwjs@骨质疏松与骨髓间充质干细胞分化调控的研究进展

龚颜，王键综述，魏劲松审校

（广东医学院附属医院骨科，广东湛江524000）

【摘要】骨质疏松是临床上常见的老年性疾病，其发病机制尚未完全明确。骨髓间充质干细胞在骨髓中可

分化为成骨细胞和成脂细胞，其分化平衡紊乱目前被认为是骨质疏松发病机制之一。了解转录水平基因调控骨

髓间充质干细胞的分化方向的机理，为骨质疏松的药物和干细胞治疗提供新思路。

【关键词】骨质疏松；骨髓间充质干细胞；转录因子

【中图分类号】R681.1【文献标识码】A【文章编号】1003—6350（2013）03—0427—03·综述·

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨

的微观结构退化为特征的，致使骨脆性增加而易发生

骨折的一种全身性骨骼疾病。临床磁共振波谱分析

发现骨质疏松患者与骨髓脂肪组织增多有关[1]。骨

髓腔中成骨细胞和脂肪细胞都起源于同一多潜能分

化的干细胞—骨髓间充质干细胞(Bonemarrow-de-

rivedmesenchymalstemcells，MSCs)。骨髓脂肪有害

增多导致骨丢失的原因被认为是成骨和成脂细胞的

祖细胞MSCs分化平衡紊乱[2]。多种分子及信号通路

在MSCs定向分化过程中起调节作用。转录水平上

MSCs成骨细胞或是成脂细胞定向分化的基因调控

机制是国内外研究的热门领域。

1成骨分化的转录水平基因调控

1.1成骨分化与转录因子RUNX2RUNX2

(Runt-relatedtranscriptionfactor－2)也被称作CBFα1

(Core-bindingfactorα1)，是转录因子(RUNT)家族成员

之一，其含有一个RUNT结构域(DNA结合区)、一个

４４８　

４讨论　手术后肠功能恢复迟缓及肠麻痹是腹部手术后　

常见的并发症，其发生的机理尚未完全阐明。目前　

普遍认为腹部手术操作及麻醉等可造成肠壁内源性　运动活性的神经性抑制，从而导致胃肠道有效的推　

进性蠕动消失，导致手术后肠功能恢复迟缓及肠麻　

痹的发生。而直肠癌行Ｄｉｘｏｎ手术后病人更有吻合　口瘘的危险，并可能进一步造成机体内环境的紊乱　

及诱发各种并发症而危及病人的生命＿ｌｊ。对此西医　

尚无积极主动的方法。本研究拟通过脉冲信号穴位　刺激疗法，寻找一种积极有效的方法来促进术后胃　

肠功能恢复。　

推按运经仪是根据中医脏腑经络学原理，结合　中医独特的针灸按摩方法，利用现代电子技术释放　

出程控式脉冲电信号来刺激穴位，使腧穴特性和人　

体生物电相吻合，疏通经络，促进脏腑功能。有研究　

发现，作为穴位物质基础的结缔组织中富集有多种　元素（如Ｃａ、Ｐ、Ｋ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ等），其中ｃａ”、Ｋ　为重　

要的信使物质，穴位结缔组织中的液晶态胶原纤维　

具有高效率传输红外光的特征波段可能存在具有受　激发辐射功能的超晶格微结构，在信息、能量交换中　

可能起极其重要的作用　ｊ。当程控式脉冲电信号刺　

激穴位时，可能通过上述机理，使机体内信息、能量　得以相互交换，解除肠壁内源性运动活性的神经性　

抑制，促进胃肠道功能的恢复。《内经》日：“大肠、小　肠皆属于胃”，程控式脉冲信号刺激足阳明胃经上的　

足三里具有健脾和胃、补益气血，上巨虚具有疏通腑　

气、行气消滞作用，配以刺激足少阳胆经上的阳陵　泉，更能调和胃肠、通利气机，从而疏通经络气血，促　进脏腑功能［引。利用改装的推按运经仪脉冲信号刺　

激结合传统针灸可以加强对穴位的刺激强度，使治　中国中西医结合外科杂志２ＯＯ６年ｌＯ月第ｌ２卷第５期　

疗效果更明显。临床应用极为方便。　胃动素是近年来在实验、临床中用于判断胃肠　

道动力情况的重要指标。胃动素ｍｏｔ是由２２个氨　

基酸残基组成的多肽，由于它刺激胃体运动而得名，　它由Ｍｏ细胞分泌，主要分布于十二指肠和上段空　

中国组织工程研究与临床康复芳73拳貂1勇绔20090101出版JournalofClinicalRehabilitativeTissueEng~eeringResearchJanuary7，2009VoLl3No．7

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变术

王志顺’，王江泳’，王保芝。，王琳。，刘长安。，王丽。，刘贵生。UltrastructurecharacteristicsofosteoblastsdifferentiatedfrombonemarrowmesenchymalstemcellsWangZhi—shun’，WangJiang．yong’，WangBao—zhi。，WangLin。，LiuChang—an。，WangLi。，LiuGui—sheng。AbstractBACKGROUND：Thereislackofstudyaboutbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)andultrastructurecharacteristicsofosteoblastsafterdlfferentiation．OBJECTIVE：ToisolateandcultureBMSCsbythewholebonemarrowcultureandadherencemethod，toinducethedifferentiationofBMSCsintoosteoblasts，andtoinvestigatethetinyandultrastructurecharacteristicsofinducedandnon󰀀inducedcellswithanopticalmicroscopeandelectronmicroscope．DESIGN．TIMEANDSETTING：ThisexperimentwasperformedattheDepartmentofHumanAnatomyHebeiMedicaIUniversityandDepartmentofOrthopaedics．BethuneInternationalPeaceHospitalfrOmMarch2007toApril2008．MATERIALS：AdultNewZealandrabbitswereobtainedfrOmAnimalExperimentCenterofBethuneInternationafPeaceHospital．Scanningelectronmicroscope(SEM)，HitachiS3500Nandtransmissionelectronmicroscope(TEM)，Hitachi7500wereusedinthisstudy．METHODS：BonemarrowwascollectedfrOmposteriorsuperioriliacspineofNewZealandrabbits．Afterprimarycultureandpassage．somethethirdpassageofcellswereincubatedin10mmol／Ldexamethasone．50mg／Lascorbateand1Ommol／LBglycerolphosphate．BMSCswereidentifiedbyalkalinephosphatase(ALP)，bonemorphogeneticproteinandcalcifiednodestaining．MAINOUTCOMEMEASURES：GeneraImorphologicalcharacteristicsofBMSCsanddifferentiatedosteoblastswereobsewedbytheopticaImicroscopeandtheirultrastructuralcharacteristicsbvtheelectronmicroscopeRESULTS：Atthethirdpassage，BMSCswerepositiveforALPstainingandnegativeforbonemorphgeneticprotein(BMP)byimmunohistochemicaIstainingandcalcifiednodestaining．butinducedBMSCswerepositiveforALPstaining，BMPimmunohistochemistryandcalcifiednodestainings．TheBMSCsshowedlongfusiformshapemostlyandafewshowedasterofOrmbvtheopticaImicroscopeandscanningelectronmicroscope．Afterinduced，cellvolumeincreased，theabundantorganellasinBMSCswereobsemedbvtransmissionelectronmicroscope．Afterinduced．mitochondrionincreasedandalotofmatrixvesicles．myelinated—likebodyandpolyvacuolus—likestructureappearedincytoplasm．CONCLUSION：Increasedmatrixvesicles．myelinated—llkebodyandpoiyvacuoluslikestructureincytoplasmmaybetheultrastructurafcharacteristicsOfBMSCsafterinduceddiferentiatingjntoosteoblasts．WangZS，WangJYWangBZ，WangL，LiuCA，WangL，LiuGSUltrastructurecharacteristicsofosteoblastsdifferentiatedfrombonemarrowmesenchymalstemcellsZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu2009；13(1)：1116【http：／／www．crter．cahttp：／／en．zglckf．com】摘要背景：目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察。目的：采用全骨髓培养．贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞，诱导其向成骨细胞方向分化，利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点。设计、时间及地点：观察实验，于200703／200804在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成。材料：成年新西兰大白兔由自求恩国际和平医院实验动物中心提供。HitachiS3500N型扫描电镜和Hitachi一7500型透射电镜。方法：从新西兰大白兔髂后上嵴处抽取骨髓。经原代及传代培养后，取部分第3代细胞加入诱导剂，诱导剂为10mmol，L0．甘油磷酸钠，10。mmoVL地塞米松，50mg／L维生素C。培养2周后，诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测。主要观察指标：光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征；电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点。结果：培养的第3代骨髓间充质干细胞，其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应：钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测，均呈现阴性结果。经向成骨细胞诱导分化后，其碱性磷酸酶染色，钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测，均呈现阳性反应。光镜和扫描电镜观察显示，骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形，少量呈星形；经向成骨细胞诱导分化后，细胞体积增大，更加饱满，似鱼群样排列。透射电镜观察显示，骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富，向成骨细胞诱导分化后，其线粒体明显增多，出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。结论：骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。关键词：骨髓间充质干细胞：细胞培养：诱导分化；骨形态发生蛋白：超微结构；电镜王志顺，王江泳，王保芝，王琳，刘长安，王丽，刘贵生．骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变[J]．中国组织工程研究与临床康复，2009，13(1)：1116[http：／／www．crter．orgh~p：Hcn．zglckf．com】