实验四 高效液相色谱-质谱联用检测饮料中的苯甲酸和山梨酸含量
（一） 目的与要求
1. 了解液相色谱-质谱联用的基本原理及分析流程；
2. 了解液相色谱-质谱联用操作技术；
3. 掌握常见防腐剂的测定方法。
（二） 原理
苯甲酸和山梨酸是饮料中较为常用的有机酸类防腐剂，对霉菌等微生物有抑制作用。苯甲酸作为苯系的化合物，会在身体内有所蓄积对身体造成损害，而山梨酸是一种不饱和脂肪酸，毒性虽然较之苯甲酸小，但是过量、长期食用将危害人体肝脏、肾脏功能。我国食品标准中规定苯甲酸、山梨酸在碳酸类饮料中的加入量不得超过0.2 g/kg。
液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术Atmospheric pressure
ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS已经成为最重要研究方法之一。
质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。
（一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。
（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。
应用高效液相色谱法测定食品中3种防腐剂的含量
摘要：近年食品抽检中发现食品防腐剂超标使用，因此了解常见食品中防腐剂含量，可为食品安全监管提供参考。采用高效液相色谱法对糖果、中式糕点及酱卤肉制品中苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸含量进行测定分析。结果表明，中式糕点均含有苯甲酸，属于违法添加苯甲酸类防腐剂的食品；酱卤肉制品山梨酸含量超过国家标准规定的限值；其他食品的苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸含量均符合国家标准规定。可见，苯甲酸、山梨酸存在超标使用问题，需要加强抽样检查监督管理力度，增加食品安全水平。
关键词：苯甲酸；山梨酸；脱氢乙酸；高效液相色谱
随着经济水平的发展和科技水平的提高，市场上不断出现各式各样、色彩鲜明、可口美味、形状各式的食品，而多数食品易受微生物影响发生腐败变质，但为了到达更好的贮藏效果，会人为的在食品中适量添加如苯甲酸、山梨酸、脱氧乙酸等常用的食品防腐剂已达到增加食品储存时间的目的。在国家发布的GB2760《食品添加剂使用标准》中就对所有类型的防腐剂在各种食品中的最多用量设定了严苛的要求，在规定范围内添加可以有效保证食品安全问题，但化学防腐剂长期且大量被人体摄入则可能会对人体有影响，如诱发癌症、导致畸变、引起中毒及其他影响人体健康的潜在危害[1,2]。因此通过合适的方法检测食品中防腐剂的含量对我们来说是非常必要的。目前国家标准或地方标准中很少有能够同时检测苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸的方法，即使有同时检测的方法但检测过程过于复杂。本文应用高效液相色谱法对6种食品中苯甲酸、山梨酸、脱氧乙酸3种防腐剂的含量进行测定。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 本次实验所用样品均采集于本市各镇商场超市、门店，实验所用主要仪器为QC系列超纯水机、离心机、数控超声波清洗器、涡旋混匀仪、电子天平；试验条件是高效液相色谱；试剂为甲醇、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸。
1.2 实验方法
1.2.1 苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸标准溶液配制
实验七 苯甲酸钠的测定
――碱滴定法
1、目的
苯甲酸钠是常用的食品防腐剂，通过实验，掌握苯甲酸钠的测定方法。 2、原理
在弱酸性溶液中，用乙醚将食品样液中的苯甲酸提出，将乙醚挥发后，用中
性酒精或醇醚混合物溶解内容物，以酚酞为指示剂，用CNaOH =0.1mol/L的标准
溶液滴定至终点，根据消耗标准碱液的体积，计算苯甲酸钠或苯甲酸的含量。 3、实验材料与仪器
3.1材料
苹果汁
（1）盐酸（1：1）
（2）乙醚（分析纯） （3）酚酞指示剂
（4）中性乙醇 以酚酞为指示剂，用标准碱液中和至微红色；
（5）中性醇醚混合液 按1：1（V/V）的比例混合，以酚酞为指示剂，用标
准碱液中和至微显红色。
（6）CNaOH=0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液 （7）氯化钠饱和溶液及纯氯化钠
（8）10%的氢氧化钠溶液 3.2 仪器
容量瓶、烧杯、分液漏斗、旋转蒸发器
4、操作步骤
称取苹果汁450g于2000ml烧杯中，加900ml饱和氯化钠进行萃取，再加45g粉状氯化钠，用10%氢氧化钠溶液中和至碱性（pH试纸实验）。将溶液依入
1500ml容量瓶中，用饱和食盐水定容，放置2h，并不时摇动，过滤。吸取滤液
20ml，放入60ml分液漏斗中，加1：1盐酸至酸性（pH试纸实验）。再加3ml盐酸（1：1），然后依次用乙醚提取，每次用量依次为15ml、10ml、10ml，每次
提取摇动不少于5min，但不能猛烈摇动，防止卤化。待静置分层后，将有机层
放入另一分液漏斗中（三次提取的乙醚层均放入这同一分液漏斗中），然后用蒸
馏水洗涤，每次用10ml，洗至洗液不呈酸性为止。 将乙醚提取液置于锥形瓶中，于40℃水浴上回收乙醚。待乙醚剩少量时，停止回收，吹干或自然挥发掉乙醚。以10ml中性乙醇溶解，并加入10ml蒸馏
水，酚酞指示剂3滴，以CNaOH =0.1mol/L的标准碱液滴至微红色为止，记录消
耗碱液的体积V。
5、计算
高效液相色谱法同时测定食品中苯甲酸山梨酸脱氢乙酸的步骤
1 材料与方法：
1.1仪器：(1)高效液相色谱仪
(2)分析天平，
(3)酸度计，
(4)离心机，
(5)振荡器，
(6)超纯水仪；
试剂：(1)苯甲酸，
(2)山梨酸，
(3)脱氢乙酸，
(4)甲醇；
提取试剂：(1)0.3%盐酸乙醇溶液,
(2)0.02mol/L磷酸氢二钾溶液
1.2标准溶液的配制
精密称取苯甲酸，山梨酸，脱氢乙酸对照品各适量，加乙醇溶解，配制成1.0mg/ml
的标准储备溶液。
1.3色谱参数和条件
（1）色谱柱：DIONEX Acclaim 120 C18(4.6*250mm,5μm)
（2）流动相：甲醇—0.02mol/L磷酸氢二钾溶液（10:90）
（3）流速：1.0ml/min
（4）进样量：10μL
（5）检测波长：230nm(苯甲酸，山梨酸)，293nm（脱氢乙酸）
1.4样品处理
1.4.1 固体样品（如熟肉制品.豆制品及糕点类）
（1）称取捣碎混匀的样品5g ( 精确至0.01g ) 于具塞三角瓶中，
（2）精密加入25ml提取溶剂，振荡1h后，于4℃放置24h ，
（3）离心，取上清液3ml，用水定量稀释至10ml，离心，经0.45 μm滤膜过滤，（4）进液相色谱仪分析。
1.4.2 液体样品( 如冷冻饮品)
（1）将样品于室温下解冻后，称取10g ( 精确至0.001g ) 于25ml 量瓶中，
（2）用提取溶剂定容至刻度，混匀，于4℃放置24h ，
（3）离心，取上清液3ml ，用水定量稀释至10ml，离心，经 0.45μm滤膜过滤，
（4）进液相色谱仪分析。
2数据处理
2.1标准曲线与检出限
