大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕【摘要】目的:探讨影响大鼠胚胎成纤维细胞(REF)分离和培养的一些因素,以建立稳定的REF培养体系.方法:取SD大鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对REF的生长形态、生长曲线进行观察,以探讨不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对REF分离及培养的影响,并对其进行免疫细胞化学鉴定.结果:13.5d 胎龄鼠胚的REF分离效果优于10.5d、18.5d 胎龄鼠胚;REF在体外为贴壁生长型细胞,第三代细胞增殖旺盛;并表达波形蛋白(vimentin)、层黏连蛋白(laminin,LN)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)蛋白.结论:13.5d 胎龄SD大鼠REF以H-DMEM做培养基,在第3代增殖旺盛,合成多种细胞外基质,最适宜作胚胎干细胞或其它悬浮培养细胞的饲养层.【期刊名称】《神经药理学报》【年(卷),期】2010(027)003【总页数】4页(P17-20)【关键词】大鼠;胚胎;成纤维细胞;层黏连蛋白;纤维连接蛋白【作者】商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕【作者单位】河北北方学院教务处,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000【正文语种】中文【中图分类】R329.2;Q256胚胎成纤维细胞饲养层是体外成功培养人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)细胞的必要条件。
主要分泌某些细胞因子如成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子[1],以促进 ES细胞增殖以及抑制分化。
同时又能分泌细胞外基质,如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层黏连蛋白(laminin,LN)等。
胰岛细胞从它们自然的细胞外基质中分离出来将可能经历一种奇特的凋亡死亡过程[2]。
为分离的胰岛移植前提供合适的微环境,许多学者采用小肠粘膜细胞、肝细胞、垂体前叶细胞、Sertoli细胞与胰岛共同培养均可使“目的细胞”的存活和功能情况明显改善[3-5]。
本研究对影响大鼠胚胎成纤维细胞(REF)分离和培养的一些因素和方法进行探索,旨在建立稳定的REF培养体系。
1.1 材料1.1.1 实验动物成年SD大鼠孕鼠(12～14d)5只,由军事医学科学院动物中心提供。
1.1.2 实验试剂 H-DMEM、胰蛋白酶(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司);青霉素、链霉素(华北制药)、台盼兰、MTT(Sigma公司);Vimentin、细胞角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)单克隆抗体、FN、LN多克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠试剂盒、生物素标记的羊抗兔试剂盒、生物素标记的羊抗兔试剂盒(中杉公司);DAB显色试剂盒。
1.1.3 实验仪器手术器械、相差显微镜(NikonTE2000)、普通光学显微镜(Olympus BH-2)、CO2培养箱(Forma公司)、酶标仪。
1.2 方法1.2.1 原代REF的制备[6]将性成熟雌鼠(6～8周龄)与雄鼠(8周龄)按2∶1比例合笼,每天早上观察雌鼠阴道口,有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)者即认定为怀孕0.5d。
取妊娠10.5～18.5d的孕鼠,按薛庆善[7]的方法制备上清液。
重复其消化过程,直至上清澄清为止。
合并各次上清,1000r/min离心5min,弃上清,以完全培养液吹吸悬浮沉淀成单细胞悬液,加入75cm2培养瓶,37℃,5%CO2培养。
1.2.2 台盼兰排斥实验检测原代REF细胞存活率将REFs单细胞悬液细胞密度调整为106细胞/ mL。
取9滴细胞悬液滴到载波片上,加1滴0.4%的台盼兰溶液,混匀。
3min之内用血球计数板分别记数活细胞数和死细胞数(注:镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,而活细胞拒染)。
根据公式:活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100。
1.2.3 二代REF培养原代REF生长铺满培养瓶后消化传代,消化液为0.25%胰酶,在显微镜下观察消化过程,见细胞变圆后立即以完全培养液(含10% FBS、100U/mL 青霉素和80U/mL链霉素的DMEM低糖培养液)终止消化。
1.2.4 细胞的冻存与复苏冻存液为1份二甲基亚砜(DMSO)与9份完全培养液混合,冻存与复苏按常规进行。
1.2.5 细胞生长曲线测定①将接种前的一部分均匀REF单细胞悬液接种于96孔板,每孔加样200μL,接种9排,每排5孔,测定1排/d;②将96孔板置于37℃孵箱里培养1d;③培养终止前4h 向所测排的每孔加入MTT 20μL;④置于37℃孵箱继续培养4h;⑤4h后吸去上清,加入150μL DMSO终止;⑥将 96孔板置于酶标仪上, 490nm测定吸光度。
1.2.6 REF细胞爬片将P0、P1、P2、P3代REF接种后留少许均匀REF单细胞悬液接种于铺有盖玻片的6孔板,每孔加样2～3mL(铺满每孔底部即可)。
37℃孵箱培养1～2d。
盖玻片上细胞密度适中,可以终止培养。
细胞爬片用PBS清洗3次;95%的酒精固定15min。
PBS清洗3次。
晾干后以中性树胶将无细胞侧贴于载玻片,待用。
1.2.7 爬片染色固定后的爬片以蒸馏水洗涤,PBS洗3次。
常规HE染色:苏木素中染色2～5min。
流水清洗,1%盐酸溶液分色。
1%氨水蓝化;流动自来水清洗爬片3次。
0.5%伊红水溶液中1～5min。
爬片进入蒸馏水中清洗。
梯度酒精脱水、二甲苯透明。
中性树胶封片。
免疫细胞化学染色按试剂盒说明书进行,苏木精复染细胞核。
阴性对照略去一抗其余步骤不变。
2.1 细胞生长曲线由图1可见第3代REF在培养至第3d时进入对数生长期,细胞快速增加,至6d时细胞数达高峰,未经明显的平台期,便进入衰退期,细胞数量下降,可见有细胞漂浮。
2.2 生长形态观察胚胎组织经胰酶消化解聚后呈球形。
REF在体外为贴壁生长型细胞,大小不均,异质性较大,原代培养约4～12 h开始贴壁,胞质向外伸出伪足而形成梭形、多边形或不规则异形等形状,中间有卵圆形核。
原代REF细胞中有时杂细胞较多,可能混杂有上皮样等细胞(图2)。
传两代后(P3)细胞才较纯,第五代(P5)以后,细胞开始老化。
可见细胞伪足增多,并有分叉,细胞内颗粒增多,细胞之间空隙较大(图3、4)。
2.3 原代消化后细胞存活率台盼兰染色后计细胞总数共1 800个,其中着色细胞(死细胞)106个,未着色细胞(活细胞)1 694个,细胞存活率94.11%。
2.4 胚胎日龄胎鼠对REF的影响10.5 d、13.5d、18.5d龄小鼠胚胎均可分离得到成纤维细胞,但10.5d鼠胚太小,不利操作,分离所得细胞数量少;18.5d鼠胚有骨细胞的混杂,分离所得成纤维细胞中杂细胞较多,且易老化;13.5d胎鼠分离所得细胞数量多,杂细胞较18.5d胎鼠少,细胞增殖能力强。
2.5 冻存对REF的影响我们对冻存的P1和P2代细胞复苏后的培养情况观察发现P1代细胞复苏后形态要优于P2代,且复苏细胞传代后与未经冻存的细胞相似,不影响其活性和功能。
2.6 爬片染色结果REF经 HE染色后(图5～图8)细胞呈梭形或多边形。
染为粉红色。
核圆或椭圆形居中,着紫蓝色,核仁明显。
免疫细胞化学结果显示:原代REF中绝大部分细胞vimentin和fibrinectin免疫反应阳性,有少部细胞呈ck18阳性。
免疫反应产物位于胞质,呈棕黄色颗粒或纤维状。
细胞核呈篮色居中,核仁明显。
3.1 胰酶消化时间在原代分离REF用胰酶消化组织细胞时,既要离散细胞间质,又要防止胰酶对细胞的损害,减少细胞因消化过度而死亡。
条件控制适当可提高原代细胞的活性。
我们的体会是:以0.25%的胰酶消化时,分次消化效果最好。
首次加入少量胰酶以吸管轻吹打,不要吹起泡沫,1min即为糊状。
难于吸取消化好的细胞。
此时可加入培养液稀释粘稠的糊状组织,不断吸取上清加入事先准备的血清终止消化。
未消化的组织块自然沉于瓶底。
继续加入胰酶消化,反复数次直至组织块基本消失为止。
这样克服了部分细胞消化过度或消化不全的问题,得到活性好产量高的原代细胞。
传代时以0.25%胰酶消化时为避免细胞受损,最可靠的方法是在显微镜下进行消化,90%细胞变圆后立即加入培养液终止消化,这种观察消化法既达到离散细胞又尽量少损伤细胞的目的。
3.2 REF生长状况从图2中可以清晰地看到,如文献所述,MEF细胞多呈棱形或条带状有少数呈不规则的三角形、星形。
原代细胞形态多样且免疫细胞化学证实混有CK18阳性细胞(上皮特异的标志),说明此时细胞纯度不是很高。
随传代的增加第二代和第三代几乎无CK18阳性细胞混杂说明纯度随传代而增加。
但传到5代以后,可见细胞伪足伸长形成明显突起并呈多极化。
不少细胞不再是正常的棱形或条带状,出现细胞形态增大、细胞边缘弯曲卷曲的,说明细胞出现老化现象。
如作为饲养层应以3、4代细胞为宜。
结合冻存对REF的影响结果,我们认为若将其作为饲养层,可以将原代分离的细胞冻存。
复苏后直接扩增使用第三代细胞作为饲养层。
3.3 染色结果的意义虽然倒置显微镜可清晰看到细胞轮廓,比较适合动态观察细胞的生长增殖情况。
但毕竟不能染色。
通过HE和免疫细胞化学染色观察了REF的特点。
根据文献报道[8],选定抗Vimentin抗体、抗Fibronection抗体、抗CK18-细胞角蛋白18(Cytokeratin 18)抗体作为一抗。
一方面鉴定分离培养的细胞的来源,另一方面对其合成的基质功能进行鉴定。
Vimentin作为间叶组织来源组织的标记物,可以作为滋养层细胞特异性分子标志。
图5免疫反应阳性反应部位呈棕黄色,位于胞质,细胞核呈淡蓝色。
说明细胞来自于间叶组织。
上皮细胞是分离滋养层细胞时较容易混杂的一种细胞。
文献报道,细胞角蛋白18在上皮细胞中表达阳性,在滋养层细胞中表达阴性,可以作为鉴定滋养层细胞纯度的特异性分子标志。
通过检测,由图8可以看出,在10倍镜下,CK18免疫组化染色没有观察到任何阳性反应产物,说明分离得到的滋养层细胞纯度较高,无上皮细胞混杂其中。
结合CK18免疫反应阴性结果说明该细胞并非上皮源性的细胞。
而其他细胞成分传代之后逐渐消失。
图6、7显示的层粘连蛋白和纤维粘连蛋白免疫阳性产物定位于胞质。
证明REF可合成细胞外基质层粘连蛋白和纤维粘连蛋白。
可见我们分离的P3代REF,纯度高,活性好,可用于饲养层制备。
【相关文献】1 Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science, 1998,282(5391):1145.2 Wang RN,Rosenberg L.Maintenance of beta-cell function and survival following islet isolation requires reestablishment of the islet-matrix relationship[J].J Endocrinol,1999, 163(2):181-190.3 Miki A,Narushima M,Okitsu T,et al.Maintenance of mouse,rat,and pig pancreatic islet functions by coculture with human islet-derived fibroblasts[J].Cell Transplant,2006,15(4):325-334.4 Woods EJ,Walsh CM,Sidner RA,et al.Improved in vitro function of islets using small intestinal submucosa[J]. Transplant Proc,2004,36(4):1175-1177.5 Hammar E,Parnaud G,Bosco D,et al.Extracellular matrix protects pancreaticβ-cells against apotosis[J].Diabetes, 2004,53(8):2034-2041.6 黄林莫,曾南,覃敏.昆明小鼠胚胎干细胞滋养层制备条件的实验研究[J].现代生物医学进展,2010,10(1):62-65.7 薛庆善.体外培养的原理与技术[M].第1版.北京:科学出版社,2001.516-517.8 Strutz F,Okada H,Lo CW,et al.Identification and characterization of a fibroblast marker:FSP1[J].J Cell Biol,1995, 130(2):393-405.。
