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大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战毫无疑问，重组蛋白在微生物中的表达革新了生物化学领域。
以前，纯化少量的目的蛋白需要处理几千克的动物或植物组织，或是大量的生物体液，这个时代已经一去不返了。
对于每个研究者来说，如果他要开始一个项目，需要某种纯化的蛋白。
他马上就会想到，怎样通过重组表达的方式获得这种蛋白。
目的重组蛋白的大量表达使人们能够对其生物化学性质进行分析，将其应用于工业并发展成为商业化产品。
从理论上来讲，获得重组蛋白的过程相当直接：获得目的基因，克隆到表达载体，转入表达宿主，诱导，纯化。
然而，实际上，事情通常并不是这样。
宿主菌生长差，包涵体的形成，蛋白无活性，甚至无法获得任何蛋白，这些都是实验中会遇到的问题。
在过去，有许多综述详细地介绍了这个课题。
综合来说，这些论文收集了2000多个例子。
然而在重组蛋白表达纯化领域，一直都在进步着。
因此，在本综述中，我们对本领域最近取得的进展做了评述。
同时，对于那些那些对异源表达还不大熟练的研究人员，我们通过回答项目开始就需要解决的问题，提供的许多选择和方法，。
这些选择和方法，在过去的几十年里，曾被成功的用来表达一系列的蛋白。
问题一：选择哪种生物体作为表达宿主？整个过程的开始就是要选择宿主细胞，利用它的蛋白合成机制来获得珍贵的蛋白。
宿主的选择决定了我们以后所需要的技术，包括各种分子工具，仪器或者试剂。
在这些微生物体中，现有的宿主系统包括细菌，酵母，filamentous fungi, 和 unicellular algae。
他们各有优点和缺点，宿主的选择可能取决于我们要表达的蛋白。
例如，如果目的蛋白需要翻译后的修饰，那么我们就要选择真核表达系统。
在本篇综述里，我们主要详细介绍大肠杆菌表达系统。
众所周知，利用大肠杆菌作为宿主具有很多优点。
1.它有无可比拟的快速生长机制，在glucose-salts培养基中，以及在最优的环境条件下，它扩增一倍的时间大约是20分钟。
Vol.53,No.07. 2019DOI：10.3969/j.issn.2095-1205.2019.07.23提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展张真汪燕马振刚（重庆市动物生物学重点实验室，重庆市媒介昆虫重点实验室，重庆师范大学重庆401331）摘要大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。
通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种既高效又经济的途径。
然而，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，而在胞质中外源蛋白不易形成二硫键，出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。
文章在近年提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达研究的基础上，从选择适当的载体和宿主、外源蛋白与其他辅助蛋白共表达、降低蛋白合成速率、提高周质蛋白表达、融合标签表达、肽标签表达、替换蛋白质中的氨基酸、改变培养基的条件等方面进行了综述，为研究者根据外源蛋白自身特点，优化外源蛋白可溶性表达方法提供了参考。
关键词外源蛋白；可溶性表达；大肠杆菌；包涵体中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:2095-1205(2019)07-37-04 Advances in Improving the Soluble Expression of EscherichiaColi Recombinant ProteinZhang Zhen Wang Yan Ma Zhengang（Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, Chongqing Key Laboratory of Vector Insects, Chongqing Normal University,Chongqing 401331）Abstract：Compared with other exogenous expression systems, escherichia coli expression system has the characteristics of high yield, easy operation, fast growth rate and low cost of recombinant protein. It is an efficient and economical way to express recombinant protein through escherichia coli. However, when expressed in escherichia coli, exogenous proteins tend to be in the cytoplasm of the reductive environment, whereas in cytoplasm, exogenous proteins are not easy to form disulfide bonds, and foreign proteins cannot fold properly, thus forming insoluble inclusion bodies. On the basis of improving the soluble expression of escherichia coli recombinant protein, the article summarized from selecting the appropriate carrier and the host, exogenous proteins are co-expressed with other helper proteins, reducing the rate of protein synthesis, improving the periplasmic protein expression, expression of fusion tag expression, peptide tag expression, replacing amino acids in a protein, changing the condition of culture medium and other aspects, providing a reference for researchers to optimize the soluble expression of exogenous proteins according to their own characteristics.Key words：exogenous proteins; soluble expression; escherichia coli; inclusion body目前大部分蛋白质功能研究需要的是可以大量纯化并且可溶的蛋白质，但不管是天然提取还是使用化学合成纯的蛋白质都是非常困难的[1]，而DNA重组技术提供了一种经济的外源蛋白获取方式。
基因工程制药综述班级：生技132XX：学号：大肠杆菌表达系统的研究进展综述自上世纪70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。
尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。
尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白构造以及功能研究的开展,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。
文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。
1 表达载体1. 1 表达调控构建有效的表达载体是表达目的基因的根本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。
标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。
理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达,然而目的基因在宿主体内过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反响, 影响蛋白的活性等。
基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代谢调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。
现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择适宜的启动子或合理开发新的载体系统。
譬如Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降, 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。
目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。
别离具有适宜强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。
大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展随着生物技术的不断发展和进步，外源性蛋白表达在医药、工业和生物制品等领域中扮演着越来越重要的角色。
然而，对于外源性蛋白表达的技术瓶颈和提高表达效率的研究，已成为了当前生物技术的热点领域之一。
而大肠杆菌作为一种广泛应用于分子生物学领域的微生物，也成为了外源性蛋白表达的研究热点之一。
本文将就大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展展开论述。
第一部分：大肠杆菌在外源性蛋白表达中的特点外源性蛋白表达主要分为原核和真核系统两类。
而大肠杆菌则被广泛应用于原核系统中。
大肠杆菌在外源性蛋白表达方面的突出特点是其具有较高的表达效率和易于操作。
其表达的蛋白质具有良好的纯度和活性。
而在表达的技术方面，大肠杆菌可以利用各种载体进行转化。
同时，其遗传背景较为简单，为碱基序列仅为4.6MB的圆形染色体。
这一特点促使大肠杆菌成为了外源性蛋白表达的优选菌株。
第二部分：大肠杆菌在外源性蛋白表达中的常用载体常用载体主要包括pUC、pET和pBAD等。
其中pUC是一种常用的负责编码外源性蛋白质的表达载体，具有高效、快速、经济等特点。
同时，pUC载体可用于亚克隆、磷酸化和DNA序列分析等相关实验。
而外源性蛋白表达的pET系列载体采用T7启动子进行表达，可以具有高效率的表达效果，还可以对靶向蛋白进行不同形式的标记，以便于在纯化时分别使用。
此外，pBAD载体也是一种经典且有效的大肠杆菌表达载体，该载体可以通过调节l-arabinose的浓度来调节目标基因的表达量。
在新型载体的研发中，通过人工合成的方法合成的RNA表达系统在蛋白表达方面也可以取得显著的进展。
第三部分：大肠杆菌在外源性蛋白表达中的最新技术1. 合成生物学的应用：近年来合成生物学在外源性蛋白表达中的应用越来越受到重视。
这项技术通过重新设计和合成生物学的元件，再结合基因表达网络及传递过程等，从而改变微生物代谢的路线，进而提高微生物的表达效率及生产能力。
D 01：10. 13523/j .cb . 2101018信号肽在大肠杆菌分泌系统中的研究与应用进展何若昱1>2林福玉2高向东“刘金毅(1中国药科大学生命科学与技术学院南京210009 2北京三元基因药业股份有限公司北京102600)摘要大肠杆菌以其明显的优势成为表达重组蛋白常用的系统，但是大肠杆菌本身不具备细胞 内形成二硫键的氧化条件和分子机制，而且高水平表达时常容易聚集形成包涵体，限制了其使 用，改善这一缺点的重要方法是通过信号肽实现蛋白质的分泌表达。
信号肽一般存在于分泌蛋 白的氨基端，能够引导蛋白质通过大肠杆菌中的Sec 或/和T a t 系统分泌至周质空间。
简要概述 了大肠杆菌中两种跨膜分泌系统和信号肽的结构，并结合近年来常用6种信号肽的研究与应用进 展，阐述了信号肽在使用中存在的问题及改进措施。
旨在为研究者合理选择信号肽、优化重组蛋 白的表达提供更多可用的信息与策略。
关键词信号肽大肠杆菌分泌系统 中图分类号Q 816大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌，拥有 操作方便、生长周期短、遗传背景清晰、表达水平高等 诸多优点。
但是大肠杆菌胞质内还原性环境不利于蛋 白质—•硫键的形成，并且局水平表达的蛋白质谷易聚 集形成包涵体。
这些因素导致重组蛋白需要经过后期 烦琐的变复性过程才能够恢复活性。
为了能够方便下 游工艺的处理，其中一个重要方法是利用信号肽将重 组蛋白引导至周质空间中分泌表达。
与细胞质相反，大肠杆菌周质空间中具备了形成二硫键所需的氧化环 境和分子机制。
Hajihassan 等〜借助信号肽将重组激 活素分泌至大肠杆菌的周质空间，使其形成了正确的 二硫键空间结构。
通常情况下，分泌蛋白的氨基末端有延伸的信号 肽，胞内与分泌相关的蛋白质可以通过识别信号肽将 其靶向细胞膜，最后信号肽酶将信号肽进行切除。
大 肠杆菌中介导信号肽分泌的系统主要包括一般分泌(the general secretory , Sec )系统和双精氛酸易位（twin -arginine translocation , Tat ) 系统，分泌 蛋白通过何 种系统分泌主要取决于自身信号肽结构。
大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
基因工程制药综述班级：生技132：学号：大肠杆菌表达系统的研究进展综述自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。
尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。
尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。
文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。
1 表达载体1. 1 表达调控构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。
标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。
理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。
基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。
现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。
譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。
目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。
分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。
Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。
开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。
1. 2 融合表达载体除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。
融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。
另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。
常见的纯化标签多根据亲和层析的配体来选择,如 6H is、GST 、CAT 、MBP 等经过一步亲和纯化可以得到均一性较高的产物, 但化学洗脱会对产物的活性产生一定的影响。
Ca2+依赖的钙调蛋白结合肽(CBP)和链球菌亲和素结合肽(SBP)作为纯化标签时, 只需要在洗脱液中移去标签依赖的离子或小分子就能实现温和的特异性洗脱[6 ,7]。
再者, 应用一些非层析的纯化标签在纯化操作中非常经济实用, 如热敏型的类弹性蛋白多肽 (ELPs)可以使蛋白产物在溶解态和非溶解态之间转变, 后续应用逆转循环的纯化方法可以达到亲和纯化的回收率[8]。
另外,在纯化标签与目的蛋白之间插入一些特殊的短肽,同时融合剪切酶可以在纯化操作中利用标签的自剪切直接得到产物蛋白。
例如 SrtAc 酶所识别的短肽序列 GTEPL, 在蛋白 N 端依次连接短肽、剪切酶、6His 融合表达,亲和上柱后剪切酶发挥作用使 N 端带有 Gly 的目的蛋白从融合状态中释放出来[9]。
噬菌体展示库是表达抗体或其它蛋白库的重要克隆技术, 与之相似将目的基因同适合的锚定序列融合可以使产物蛋白表达到大肠杆菌的表面。
大肠杆菌展示所用的融合配体一般为细菌的膜蛋白或跨膜转运体,如 PadL 是大肠杆菌长链脂肪酸的一种外膜转运体蛋白,N 端融合 PadL 表达胞酶,以全细胞的形式催化反应表现出非常高的稳定性[10] ；Yang 等利用恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida 外膜酯酶 EstA 的转运结构域作为表达胞β-酰胺酶的锚定基序, 结果表明蛋白展示在细胞膜外并没有影响细胞的活力[11]。
1. 3 共表达载体很多真核基因表达的产物都必须以多聚复合体的形式组合才能表现出相应的活性, 因此在表达这一类目的基因的时候常构建共表达载体,另外共表达的策略在辅助新生蛋白质的折叠和分泌中也很有意义。
Dzinenu 等针对表达异源二聚体构建了可以同 pET 载体共表达的载体 pOKD ,这种载体含有 p15A 复制起点, 所以可以和大多数大肠杆菌表达载体共存于细胞中[12]。
细菌释放素蛋白 (BRP)属于细菌中的一类分泌蛋白, 共表达目的蛋白与BRP 可以促进产物直接释放到培养基中[13]。
另外,共表达分子伴侣也是促进蛋白正确折叠的手段。
目前对于分子伴侣构成的网络模式还处于探索阶段, 研究发现大肠杆菌中常见的分子伴侣 GroEL、H sp 同系物 DnaK 并非细胞所有蛋白折叠所必需的, 只有同核糖体结合的触发因子协调作用才能促进蛋白的适当折叠[13]。
但是, 合理选择个别的分子伴侣共表达可以避免产物在细胞错误的折叠以及沉积。
M arco 等设计了共表达分子伴侣的 3 载体系统, 其中两种载体分别携带不同的分子伴侣, 另外一种载体携带目的基因, 分子伴侣与目的基因被分别独立诱导[14]。
Cpn60 和 Cpn10 是从嗜冷菌中分离的一类分子伴侣, 共表达后可以使大肠杆菌在 4℃低温下生长, 有利于蛋白的正确折叠[15]。
与分子伴侣类似, 共表达DsbA 或 Dsbc 等二硫键相关蛋白可以辅助形成正确的二硫键。
1. 4 双杂交系统融合表达和共表达的另一个应用是利用双杂交系统研究蛋白质的相互作用。
大肠杆菌双杂交系统也是有 3 种载体构成,诱饵蛋白融合表达载体、捕获蛋白融合表达载体和报告基因表达载体[16]。
以 AraC /LexA 双杂交系统为例,诱饵载体的启动子选用 IPTG 诱导的 pTrc, 诱饵蛋白融合在转录激活因子 ArcC 的 N 端表达, 带有卡那霉素的抗性基因; 捕获载体的启动子选择非IPTG 诱导的 pTet,可以在去水四环素的诱导下转录, 捕获蛋白融合在LuxA 操纵子效应物 LuxA 的 N 端, 带有氨苄青霉素的抗性基因; 报告基因 LacZ 的启动子选用大肠杆菌的 araBAD 启动子, 其活性依赖于上游的 AraC 操纵子, 同时在启动子下游安置 3 个定向重复的 LexA 操纵子半位点, 载体带有大观霉素的抗性基因,另外在 AraC 上游插入 4 个串联的 rrnB 终止子,减小转录通读对报告基因活性的背景影响。
此 3 载体共表达系统的特点是诱饵蛋白同捕获蛋白分别独立诱导,可以通过控制诱导物的浓度逐步放大杂交蛋白相互作用对报告基因表达的抑制效应。
诱饵蛋白与捕获蛋白分别结合在上游和下游的 2 个操纵子上, 如果二者可以发生杂交作用, 则在报告基因的 DNA 链上形成突环, 使 AraC 转录激活效应发生逆转, 所以通过菌落的蓝白斑差异可以筛选出发生相互作用的蛋白质。
1. 5 Univector 系统通常在构建重组子表达时需要依赖限制性切酶和连接酶的作有, 进行亚克隆, 而利用同源重组开发的载体可以实现基因的一次性克隆。
Univector 表达系统(UPS) 就是这方面较为成功的实例[16]。
Univector 系统由两类载体组成(图 1): 一种称为万能的进入载体 pUN1, 具有特殊的 loxP 重组序列,通过重组酶 Cre 可以方便地穿梭进入表达载体; 另一种即表达载体 pHOST , 同样具有 loxP 序列, pHOST 是由不同的启动子与融合标签组成的载体系列, 便于高通量筛选蛋白产物。
Univector 系统的特点是平行独立克隆到多载体中, 使之在不同的诱导条件下表达, 大大提高了表达的成功率, 尤其在蛋白组的研究中具有很大的应用潜力[3]。
2 宿主细胞在大肠杆菌细胞表达目的基因的主要优势: 一个是宿主的遗传背景比较清楚, 易于控制基因的表达; 另一个是大肠杆菌容易培养, 可以获得较高产量的目的蛋白。
但是在商业应用中很多的蛋白产物是真核基因编码, 并且具有高级的三、四级结构, 要求翻译后加工为正确的折叠形式或者糖基化蛋白等。
由于大肠杆菌细胞的分子环境和折叠机制等与真核细胞具有很大的差异, 所以在应用大肠杆菌系统表达真核基因时有必要利用代工程或进化的方法改造细胞, 解决大肠杆菌表达系统的局限性, 提高产物的活性。
2. 1 代工程载体携带目的基因进入宿主表达会给宿主本身造成代上的负担, 影响细胞的生长速率等, 推测可能是因为宿主不能提供足够外源基因表达所需的原料及能量。
减轻表达对于宿主的压力可以通过控制质粒的拷贝数或者改变载体的抗性基因,还可以将目的基因直接插入染色体中表达。
Flores 等则是将磷酸戊糖途径的代关键酶—6磷酸葡萄糖脱氢酶的基因克隆到多拷贝质粒中, 转化大肠杆菌使细胞的生长速率在诱导后得到恢复[17]。
除了利用大肠杆菌的代机制改进表达系统 ,另外还可以人为地在大肠杆菌中设计代途径, 例如 Masip 等设计的二硫键合成途径。
在大肠杆菌中催化二硫键形成的是周质蛋白 DsbA ,此蛋白通过膜蛋白 DsbB 得到循环利用。
Masip 等选择硫氧化还原蛋白 TrxA 作为二硫键的供体, 使之在氧化态的胞质形成二硫键, 通过融合 Tat 特异性前导肽从细胞质转运到周质,使重组蛋白在周质获得二硫键。
因此这一途径不依赖 DsbADsbS 体系,仅通过胞的硫氧化还原蛋白就能形成二硫键,所以可以修复缺失 DsbADsbB 体系的宿主[18]。
2. 2 定向进化通常重组蛋白对于细胞的蛋白酶都很敏感,为了避免蛋白酶的作用除了分泌表达外还可以对相关的蛋白酶进行突变,例如筛选缺乏 ATP 依赖的胞蛋白酶的菌株, 但是对于是否细胞因此而上调其它的蛋白酶浓度还不清楚。
另外在周质中的蛋白酶也会降解产物蛋白, DegP 蛋白是存在于细胞周质中的主要蛋白酶, 所以可以应用 degP 失活的宿主表达蛋白。
同时,C 端为非极性的蛋白应该在 prc 突变的宿主中表达(Prc 蛋白酶作用于 C 端非极性的蛋白), 或者以 N 端融合形式表达[19]。
