大肠杆菌表达系统详细表格

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T7表达系统
大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录 体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统 称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合 酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高 活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚 合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合 酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7 噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转 录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动 子控制的基因的转录能达到很高的水平。
1) 克隆基因的mRNA的高效翻译不仅依赖于核糖体结合位点 的存在，而且受编码起始的核苷酸序列的影响。这可能是链间 配对形成的次级结构可以影响核糖体与其结合位点的结合。如 果相关的序列是由E. coli序列组成，可以避免这一可能性。
2) 在融合蛋白中存在细菌肽可以稳定分子阻止被寄主细胞 降解。
3) 细菌片段可能含有信号肽，引导重组蛋白运输到胞外。 如ompA或者malE基因，这样重组蛋白可以被输出到细胞外，进 入培养基或者质膜空间。可以简化重组蛋白从培养物中纯化。
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启动子
核糖体结合位点 复制起点
转录终止子
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常用的大肠杆菌表达载体
1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体
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Lac启动子的表达载体
lac启动子：控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因 转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物 后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。
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大肠杆菌表达外源基因的优势
• 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 • 基因克隆表达系统成熟完善 • 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 • 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
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大肠杆菌表达外源基因的劣势
• 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 • 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 • 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异
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pPLc24表达载体： 用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。
这个质粒表达载体含有MS2-聚合酶基因开始的98个密 码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表 达。
在MS2-聚合酶基因下游，存在BamHI和HindIII 单切点。EcoRI单切点靠近λ PL启动子，处于转译起 始密码子之前。
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b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基
因，很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效 的表达。
不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源 基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。
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5. 寄主细胞的生理状态对基因表达效率 的影响 培养基营养成分的选择、细胞培养 方式、培养温度等环境因素能影响大肠 杆菌生理状态。
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3. 宿主细胞
在大肠杆菌细胞内表达目的基因的主要 优势:一个是宿主的遗传背景比较清楚,易于 控制基因的表达;另一个是大肠杆菌容易培养, 可以获得较高产量的目的蛋白。但是在商业 应用中很多的蛋白产物是真核基因编码,并且 具有高级的三、四级结构,要求翻译后加工为 正确的折叠形式或者糖基化蛋白等。由于大 肠杆菌细胞的分子环境和折叠机制等与真核 细胞具有很大的差异,所以在应用大肠杆菌系 统表达真核基因时有必要利用代谢工程或进 化的方法改造细胞,解决大肠杆菌表达系统的 局限性,提高产物的活性。
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4>. 转译起始序列 5’-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效
率。 5>. 转译增强子
显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效 率。 6>. 转译终止子
mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在 其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转 译终止的效率便会得到进一步的增强。
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优点： 1. 蛋白质的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋
白容易纯化 3. 增进了蛋白质的折叠作用 4. 蛋白质N-末端的结构真实
缺点： 1. 在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质，通
常是不会分泌到胞外培养基中去的 2. 由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因 此目标蛋白质的纯化过程比较复杂
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4.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响 a. 密码子使用的偏爱性现象的规律性
几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个 或两个是优先使用的偏爱性密码子；
一些密码子在各种不同基因中都是最常用的 （在编码脯氨酸4种同义密码子，CCC是优先 使用的）
高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈 现出较高程度的密码子偏爱性 简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRN A丰度。
1. 大肠杆菌染色体DNA的5.4kb HindIII 片断， 含 有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、 trpE基 因、 trpD基因的部分序列。
2. 将此片断，克隆到pBR322质粒的HindIII 位点， 构建成了ptrpED3表达载体（含有两个HindIII 位点）。
3. HindIII部分酶切消化，将靠近EcoR1位点的一个 HindIII 位点，经核酸外切酶和S1核酸酶处理，消除掉 构建新的质粒载体ptrpED5-1.
4) 细菌片段可以通过亲合色谱法辅助重组蛋白的提取。例 如与E. coli 谷胱甘肽-S-转移酶融合的蛋白可以吸附到含有结 合谷胱甘肽的琼脂糖柱上。
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2.外源基因在大肠杆菌细胞中的表达
• 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位 • 融合蛋白质的表达 • 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性
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2.1 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位
影响 当mRNA分子5’－末端与SD序列之间的长度小于1
5bp时，转译效率下降。
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、
2. 质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影 响 a. 质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响 b. 质粒载体的不稳定性对表达效率的影响
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3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影 响 a. 转译起始序列对表达效率的影响 SD序列后面的4个碱基，T或A时转译作 用较高，C或G时，下降50%或25%； 位于起始密码子AUG上游的密பைடு நூலகம்三联体 的碱基，CUU或UAU时转译效率最有效，UUC、 UCA或AGG时下降20倍； 位于起始密码子AUG下游的密码子碱基 组成，也影响转译的速率。 b. mRNA的稳定性对表达效率的影响
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PL启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启
动子之一. λPL启动子：是负责λ DNA分子 转录的启动子之一。λPL启动子是可以被 E. coli RNA聚合酶所识别的强启动子，转而 转录噬菌体DNA。该启动子可以被λcI基因产 物所抑制。携带λPL启动子的载体使用温度 敏感的E. coli cI突变体。在较低的温度下， 突变体所产生的cI蛋白可以抑制 λPL启动子， 在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基 因的转录。
a. 目标蛋白质的纯化比较简单 b. 蛋白质酶解的程度不甚严重 c. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化 环境） 缺点： a. 信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 b. 有可能形成包涵体
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3>.胞外表达： 使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分
泌到胞外培养基中进行分离纯化。 途径：
1. 用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型 的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效 的程序） 2. 诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致 胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。（可以分离到 中等产量的蛋白质）
理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操 纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载 体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有 一条足够大的编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。 因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个 启动子之后,仍保持着lacZ基因固有的读码结构时， 这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码 的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质.
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质粒的构建： 将含有lac启动子的HaeIII 酶切片断，经平末
端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填 补修复的pBR322质粒上。
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Trp启动子的表达载体
色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的 被3-β-吲哚丙烯酸诱导。这种表达载体的优点是，它 所合成的蛋白质产量高于lac启动子表达载体系统，并 且是诱导型的。 构建：
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4.大肠杆菌表达系统研究的新 进展
近几年来，国内外大肠杆菌表达系统研 究的重点已从构建各种表达载体，建立新的 表达系统转移到完善现有的表达系统，解决 表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究 工作主要包括重组蛋白质的正确折叠，构象 形成和分泌，菌体表面表达技术及其应用， 重组蛋白质修饰加工研究等内容。
缺点： a. 折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性 b. 蛋白质的终产量偏低 c. 蛋白质的生产成本比较昂贵 d. 蛋白质种类多，因此纯化比较复杂
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2>. 周质中表达： 周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内
膜和外膜之间的细胞结构部分。 在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细
胞质中穿过细胞质内膜进入周质。 优点：
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大肠杆菌表达系统
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1.大肠杆菌表达体系的组成
一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有 表达载体和宿主菌两部分构成。为了改善表 达系统的性能和对各类外源基因的适应能力， 表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒 或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功 发展了许多表达载体和相应的宿主菌。
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Cassettes和基因融合 一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要
E. coli核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达 信号组成一个cassette。