枯草芽孢杆菌的10L发酵罐分批发酵

发酵罐中补料分批发酵研究实验目的加深对培养方法的认识，了解补料分批续培养过程控制方法。

实验原理补料分批培养，是一种介于分批培养和连续培养之间的过渡培养方式，是在分批培养的过程中，间隙或连续地补加新鲜培养基的培养方法。

流加培养同时兼有间歇培养和连续培养的某些特点，其优点是，可使发酵系统中维持很低的底物浓度，减少底物的抑制或其分解代谢物的阻遏作用，不会出现当某种培养基成分的浓度高时影响菌体得率和代谢产物生成速率的现象。

菌种与培养基啤酒酵母培养基(g/L)葡萄糖20，酵母浸粉 5.0，KH2PO43.0，Na2HP041.0，MgSO41.0，pH 5.0。

流加的浓葡萄糖液质量浓度为25 g／100 ml。

保持培养基中糖的质量浓度在0.5 g/L，流加液的糖的质量浓度为25—30 g/100 m1。

实验方法流加培养前的准备工作在培养罐中加入去离子水，将温度传感器、除菌过滤器安装好，用硅橡胶管连接好取样口、流加液入口，不需要的接口全部封好。

橡胶管用弹簧夹夹住，排气口用一小段棉花塞好。

确认所有连接没有问题后，打开通风排气系统，检查是否有漏气、阻塞现象(轻轻堵住排气口，看其他地方是否漏气)，确认正常。

种子培养自斜面菌种挑起一环啤酒酵母菌体。

接入装有50ml 培养基的250 ml三角瓶中，摇匀后，置于24℃培养箱培养36 h。

将上述培养好的液体种子接入用250ml三角瓶装的灭过菌的100ml液体培养基中，接种量10％，在24℃下培养36h。

流加培养培养罐中加入已调配好的培养基后，放在灭菌锅中灭菌121℃，20－30 min，葡葡糖和消泡剂分别同时灭菌。

培养罐取出后，开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,冷却到发酵温度25 ℃。

利用硅皮管将25 g/100m1葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。

消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。

枯草芽孢杆菌酶在发酵工艺上的应用王伟王上俞志敏丛丽娜*（大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034）摘要：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶的主要生产菌种之一，由于其产酶量高、种类多、安全性好、环保等优点在现代发酵工业生产中被广泛应用，其发酵生产的酶在工业、医学、食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸、水产养殖等领域均发挥着十分重要的作用。

关键词：枯草芽孢杆菌；发酵；酶B. subtilis enzyme used in the fermentation processWANG Wei WANG Shang YU Zhi-Min CONG Li-Na*(School of Biological Engineering,Dalian polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034, China) Abstract:Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) is one of today's major producing strain of industrial enzymes,enzyme production because of its high volume,variety,safety, environmental protection,etc.are widely used in modern industrial production fermentation,fermentation enzymes produced in the fields of industry,medicine,food, feed,wash,textile,leather,paper,aquaculture and other have played a very important role. Keywords:Bacillus subtilis; fermentation; Enzyme长期以来，枯草芽孢杆菌一直是工业微生物的主力军之一，它的使用可追溯到一千多年前，早在日本平安时代（794～1192年）日本人就已经利用枯草芽孢杆菌在大豆中采用固态发酵的方法生产他们的传统食品——纳豆，开创了利用枯草芽孢杆菌的历史[1]。

发酵工程_华中科技大学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年1.发酵工程的目标不包含（）答案:无污染2.下列哪项不是微生物本征动力学参数？答案:微生物比生长速率μ3.微生物发酵过程中底物消耗速率取决于多种因素，其中不包括（）答案:细胞得率4.下列发酵产物属于非生长相关型的是（）答案:抗生素5.下列不是分批发酵优点的是（）答案:发酵设备外的外围设备利用度高6.下列关于分批发酵的说法错误的是（）答案:分批发酵过程中碳源耗尽时需进行补料维持发酵7.连续发酵处于流动状态，不属于稳态过程。

答案:错误8.底物比消耗速率qs是指单位质量细胞在单位时间内的底物消耗量。

答案:正确9.乙醇发酵按照Ganden的分类方法属于非生长相关型。

答案:错误10.分批发酵过程中如果目的产物为初级代谢产物，则可设法延长稳定期获得更多的产物。

答案:错误11.发酵液pH的改变会对发酵体系产生很大影响，影响菌体生长和产物代谢方向。

答案:正确12.根据氧传递方程的推导，在氧传递过程中的主要阻力是（）答案:液膜阻力13.关于气体溶解过程双膜理论以下说法错误的是（）答案:气膜内气体分子和液膜内液体分子以对流状态流动14.发酵过程中的氧传递方程式OTR=KLa(C*-CL)中，C*-CL代表（）答案:氧浓度推动力15.以下不是通过影响氧饱和浓度来改变推动力的因素是（）答案:微生物的耗氧能力16.通气准数Na与搅拌转速、通气线速度以及搅拌桨直径相关。

通气搅拌功率和搅拌轴功率的比值PG/P=1-12.6Na与PG/P= 0.62-1.85Na成立时，要求Na分别满足（）答案:＜0.035；≥0.03517.下列关于表面活性剂对KLa的影响的说法中，错误的是（）答案:随着表面活性剂浓度的增加a上升至最大值后保持不变18.一般来说高产菌具备的特点是呼吸强、生长快、代谢旺盛、产物专一。

答案:错误19.对好氧微生物的发酵过程进行温度控制时，应该在保证最适酶活的温度范围内尽可能选择较低的温度，以提高氧传递的推动力。

发酵培养基的制备和实罐灭菌一、实验目的要求学生掌握通风发酵的基本原理及过程，掌握上罐操作技术，掌握流加补料控制技术。

（1）发酵罐及管路、空气过滤器灭菌操作及发酵罐系统管路的熟悉（2）实罐灭菌—培养基灭菌实验二、实验原理2.1 培养基组分的种类和作用：人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物的营养物质。

主要包括：碳源、氮源、无机盐、生长因子、前体2.2 实罐灭菌原理保温温度（℃）加热保温冷却温度（℃）时间（min）三、实验仪器、设备和材料10升发酵罐（PH仪，培养液及酸碱液流加装置，蠕动泵），1台；淀粉水解糖液、尿素等原料。

四、实验内容与方法：酵母菌经扩大培养后，接入10升机械搅拌通风发酵罐培养，根据实际情况选用分批培养或分批补料培养，测定酵母浓度。

主要内容有：试管斜面培养基的配制、面包酵母种子扩大培养基配制、流加用培养基的配制及灭菌。

总流程：斜面培养基配制与灭菌所需仪器物品：灭菌锅、试管、棉塞、培养基原料、培养箱300毫升种子液、500ml三角瓶三只、装液100ml、培养基、培养摇瓶、纱布。

发酵培养基制备，灭菌。

面包酵母菌的培养基组成：酵母斜面培养基：10º麦芽汁固体斜面，PH5.0酵母摇瓶培养基：10º麦芽汁，PH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.0酵母分批发酵培养基：玉米淀粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%、玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.5。

五、实验报告内容和数据处理实验设计原理；发酵系统的结构与操作方法；实罐灭菌工艺。

附：机械搅拌发酵系统介绍：1 技术指标1.1 概述具有温度、转速、氧气流量、空气流量、pH 、DO 、补料、消泡显示及控制功能，并配有机械消泡浆。

1.2指标1.2.1温度：自动控制范围：自来水温+5℃～ 50℃﹙±0.2 ℃﹚显示范围：0 ～150 ℃1.2.2搅拌转速：调速范围50 ～1000±5rpm1.2.3空气流量：显示控制范围0 ～ 10L/min1.2.4pH显示控制：2 ～12pH±0.05﹙酸碱双向﹚1.2.5溶解氧：0 ～150±2℅1.2.6补料、消泡蠕动泵各一台1.2.7 罐体总容积10L,设计压力2.0kg/c㎡、最高工作压力2.0kg/c ㎡,设计工作温度131 ℃1.2.8 灭菌方法:手动控制蒸汽消毒灭菌1.2.9 功率：主机：3kw, 单相220v1.2.10 气源：2 ～4kg/c㎡1.2.11 蒸汽： 2 ～4kg/c㎡2 管路说明该流程图中空气管路阀门的标号为“AXX”,蒸汽管路阀门的标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”,冷冻水管路标号为“CWX”，其它气体管路标号为“NXX”。

图表比较分批发酵、连续(流加)发酵与分批补料发酵优缺点? 表一:分批发酵、连续(流加)发酵与分批补料发酵简单比较呼吸作用与发酵的根本区别在于:电子受体不就是将电子直接传递给底物本身的中间产物,而就是交给电子传递系统,并逐步释放能量后再交给最终的电子受体。

4、发酵过程杂菌污染的途径有哪些？如出现杂菌污染,应如何处理？答:发酵过程杂菌污染的途径有1、种子带菌,2、培养基及设备消毒不够,3、设备破损,4、空气系统,5、操作不当(取样、补料、消泡、控制)等。

(2分)如出现杂菌污染,应对染菌时间、种类、染菌规模进行分析根据具体情况处理,(1分)如:1、种子带杂菌——灭菌,排掉。

(0、5分)2、发酵前期——严重:实消后补种、料。

不严重:运转并观察。

(0、5分)3、发酵中期——分析微生物数量、种类、物料性质,再做处理。

(0、5分)4、发酵后期——同中期,并考虑产率与成本关系,考虑放罐。

(0、5分)5、连续发酵有何优缺点？答:(1)、设备生产能力大、利用率高、没有中间清洗杀菌、没有发酵适应期。

(1分) (2)、连续化、自动化、人平生产率高、成本降低。

(1分)(3)、发酵稳定、便于管理。

(1分)缺点:营养利用率略低、控制要求高。

(2分)6、摇瓶提高溶氧方法有哪些？发酵罐提高溶氧方法有哪些？答:摇瓶提高溶氧可考虑减小装液比,增加摇床转速,不会造成染菌的情况下减少瓶口砂布层数等方法。

(3分)发酵罐提高溶氧的方法有选择合理罐型,增加高径比,适当提高通气量,适当提高搅拌速度(搅拌罐)等方法。

(3分)6、泡沫对发酵有何影响？常用的消泡方法有何优缺点？答:泡沫对发酵的影响有:(1)泡沫持久存在,妨碍CO2的排除,影响微生物对氧的吸收,破坏正常生理代谢,不利发酵与生物合成。

(2)泡沫大量产生,使发酵罐有效容积大大减少,影响设备利用率。

(3)泡沫过多,控制不好,会引起大量跑料,造成浪费与环境污染(4)泡沫升到灌顶,可能从轴封渗出,增加染菌机会(5)泡沫过多也会影响氧传递、通风与搅拌效果。

微生物发酵方式一般分为分批发酵、连续发酵和补料分批发酵。

一、分批发酵分批发酵是将发酵培养基一次性投入发酵罐中，经灭菌、接种和发酵，最后一次性地将发酵液放出的一种发酵操作。

分批发酵过程中，除不断通气和加入酸碱溶液以维持发酵环境外，与外界没有物料交换，减少了污染机会。

其主要特征是所有工艺变量都随发酵时间的变化而变化。

分批发酵过程中的代谢变化一般可分为菌体生长，产物合成和菌体自溶3个阶段: （1）菌体生长阶段菌体生长阶段处于发酵前期，这一阶段主要是菌体适应新环境，开始生长繁殖，增加细胞数量，直至达到菌体临界浓度。

为减少种子液转入发酵培养基后，对新环境的适应时间，种子培养基的主要成分应尽可能与发酵培养基的成分一致。

此阶段的代谢变化，主要是培养基中碳源、氮源等的分解代谢和细胞内物质的合成代谢，即营养物质不断被消耗，新菌体不断合成，溶解氧水平不断下降。

当其中某一因素成为限制因素时，菌体生长速度会减慢至一临界值，菌体由生长阶段转入产物合成阶段。

（2）产物合成阶段产物生成阶段处于发酵中期，此时菌体量增加趋于稳定，代谢以合成产物为主，产物生成速率达到最大。

发酵液pH、温度和溶氧等参数都会影响发酵过程中的代谢变化，增加副产物的生成，影响产量。

保兴赛斯的生物反应系统可对一系列参数进行检测并反馈，以了解菌体生长状态，调整最佳发酵环境。

（3）菌体自溶阶段菌体自溶阶段处于发酵后期，此阶段的代谢特征主要表现为菌体开始衰老、自溶，产物合成能力衰退，氨基氮含量增加，pH逐渐回升。

此时发酵必须结束，否则不仅可能会使产物受到破坏，还会加大发酵后处理的困难。

保兴赛斯生物反应器在配置相应硬件后，其高级监控软件可根据氨基氮、菌浓、发酵单位等检测数据，生成相应代谢曲线。

对代谢曲线进行研究分析，能掌握代谢变化的规律，发现工艺操作中存在的问题，有助于改进工艺，提高产量。

二、连续发酵连续发酵是当微生物培养到对数生长期时，一方面以一定速度连续不断地向发酵罐中流加新鲜液体培养基，另一方面又以同样的速度连续不断地将发酵液排出。

枯草芽孢杆菌生产工艺枯草芽孢杆菌是一种重要的微生物资源，在农业生产和环境保护中有着广泛的应用价值。

枯草芽孢杆菌能够分解有机物质，产生一系列生物活性物质，具有杀菌和促进植物生长的作用。

下面将介绍枯草芽孢杆菌的生产工艺。

1. 菌种培养首先要获得高质量的菌种，一般选择枯草芽孢杆菌的自然菌株或者已经纯化的菌株作为菌种。

然后将菌种接种到适合生长的培养基中，通过搅拌培养，保持适宜的培养条件（温度、pH 值、氧气含量等），使得菌种能够迅速繁殖。

2. 发酵培养将菌种转入发酵罐中进行发酵培养。

发酵罐中应该具备良好的通气性和温度控制系统，以确保菌种的正常生长和代谢。

在发酵过程中，要控制培养液的pH值，保持在适宜的范围内（一般为6-8），并添加适量的碳源和氮源，加速菌种的生长速度。

3. 发酵液分离发酵液中的细胞和液体部分需要进行分离，以获取纯净的发酵液。

可以通过离心和过滤等方法进行分离，将液体部分收集下来。

4. 提取和纯化将收集到的发酵液进行进一步处理，以得到所需要的活性成分。

可以采用溶剂提取、蒸馏浓缩、纯化柱层析等多种方法进行处理，去除无关化合物，得到目标物质。

5. 成品包装对纯化得到的目标物质进行检测和质量评估，确保其符合标准要求。

然后将成品进行包装，以便储存和使用。

需要注意的是，枯草芽孢杆菌的生产是一个复杂的过程，需要细致的操作和科学的控制。

在每个环节都要注意卫生和安全，防止外界的污染和菌株的变异。

同时，还需要对每个步骤进行合理设计和优化，以提高生产效率和产量。

枯草芽孢杆菌的生产工艺是一个有挑战性的任务，但通过不断的研究和改进，相信可以进一步提高该菌株的产量和质量，推动其在农业和环境领域的应用。

枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于自然环境中的益生菌，具有很强的生物防治能力，能够有效地对抗多种有害微生物，促进植物生长和提高产量。

而枯草芽孢杆菌的发酵方法对于生产和应用起着至关重要的作用。

枯草芽孢杆菌的发酵方法的核心步骤包括种子培养、发酵过程和发酵液收获。

下面我将按照从简到繁的顺序，逐步探讨这些步骤。

1. 种子培养种子培养是整个枯草芽孢杆菌发酵过程的起点。

选择一株活力强、菌液浓度高的枯草芽孢杆菌菌株。

将该菌株接种到适宜的培养基上进行预培养，以增加菌株数量。

预培养的时间和温度要根据具体情况而定，但通常在30-37摄氏度下静置培养24-48小时。

培养基的选择也很重要，常见的有蔗糖蛋白胨培养基和复合液体培养基。

2. 发酵过程发酵过程是枯草芽孢杆菌大规模生产的关键步骤。

将预培养好的种子菌液接种到大型发酵罐中，酒精发酵罐是一种常见的选择。

接种量的大小要根据发酵罐的容积和发酵需求进行合理调整，通常在5-10%左右。

接种后，利用适宜的培养基和培养条件（如温度、pH值、氧气供应等），进行连续或分批发酵。

在发酵过程中，菌株会迅速繁殖和产生代谢产物，如抗生素、激素、酶等。

这些代谢产物对枯草芽孢杆菌自身和植物都具有促进作用。

在发酵过程中，需要注意对发酵液的搅拌、通气和温度的控制，以保证菌株的良好生长和代谢产物的高效产生。

3. 发酵液收获在发酵过程结束后，需要对发酵液进行收获和提取。

停止菌液的搅拌和加热，然后通过过滤或离心等方法将菌体和固体物分离。

接下来，可以通过浓缩、纯化和干燥等工艺对发酵液进行加工处理，以获得高纯度和高活性的枯草芽孢杆菌制品。

除了基本的发酵方法外，还有一些优化的发酵技术值得关注。

可以通过添加生物碳源来促进枯草芽孢杆菌的生长和代谢产物的产生。

适当的控制发酵液中的pH值，可以提高菌株的生长速度和产量，同时减少杂质的形成。

还可以利用发酵代谢过程中产生的热能，实现能源的再利用，提高发酵过程的能效。

枯草芽孢杆菌的发酵方法是一个复杂的过程，需要精细的操作和严格的控制。

枯草芽孢杆菌发酵培养基配方1. 引言大家好，今天咱们聊聊一个很有意思的话题，那就是枯草芽孢杆菌的发酵培养基配方。

听起来好像有点高大上，其实就是让小细菌们在一个舒适的环境里茁壮成长嘛！说到这里，你可能会问：“这枯草芽孢杆菌到底是个啥？”别急，咱慢慢来。

枯草芽孢杆菌，顾名思义，跟“枯草”有点关系，它能在各种环境下生存。

说白了，就是个“生存达人”。

咱们用它来做发酵，能够帮助咱们在农业、医药等领域有更好的应用，比如促进植物生长、提高土壤肥力等。

这可是个大忙人，嘿嘿！2. 培养基的组成2.1 基本成分那咱们要怎么调配这个培养基呢？其实挺简单的，先来看看基本成分都有哪些。

主要的配方有：1. 水：这是培养基的灵魂，少了水可不行，细菌可是“水中精灵”。

2. 营养琼脂：这个东西就像细菌的“营养快线”，能给它们提供成长所需的各种营养素。

3. 葡萄糖：别小看这糖，细菌可是特别喜欢这个，吃了能让它们“嗨”起来，分分钟活力四射。

4. 氮源：比如蛋白胨，帮助细菌合成蛋白质，细菌们得有营养才行啊。

这几个成分调配好，就像调制一杯完美的鸡尾酒，嘿嘿！2.2 其他成分除了基本成分，咱们还可以加入一些“调味剂”。

比如：1. 磷酸盐：帮助细菌更好地利用能量，别小看这个，重要得很呢。

2. 微量元素：铁、锰这些，虽然含量不多，但对细菌来说可是大补品，简直是“细菌的维生素”。

3. pH调节剂：有时候环境酸碱度不对，咱们得调调，保证细菌在最佳状态下发酵。

配方就像是做饭，想要味道好，就得多尝试，多调整，找到那个完美的平衡点！3. 制备步骤3.1 具体步骤好啦，现在咱们来聊聊怎么把这些成分变成培养基吧。

其实步骤很简单：1. 准备好所有材料：一切准备就绪，像个小厨师一样。

2. 称量成分：按比例把营养琼脂、葡萄糖、氮源等称好，别马虎，量要准。

3. 溶解：把称好的成分放进水里搅拌，直到完全溶解，就像搅拌奶茶一样，直到没有颗粒。

4. 灭菌：这一点特别重要，得把细菌们的“敌人”消灭干净，才能让咱的枯草芽孢杆菌尽情生长。