动物生物化学实验四
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实验四酪蛋白的制备
教学目的与要求：理解蛋白质两性性质和胶体的有关特性。
教学重点与难点：重点是掌握一种提取蛋白质的方法；难点是蛋白质提取的纯度。
教学方法与手段：讲授和学生动手操作。
学时安排：2学时
教学内容：
一、引言
蛋白质是两性电解质，蛋白质分子中可以解离的基团除 N- 端 a- 氨基与C- 端 a - 羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、羟基、胍基、咪唑基等基团,它们都能解离为带电基团。
因此，在蛋白质溶液中存在着一种平衡。
调节溶液的 pH 使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等,即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同 pH 的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。
二、实验目的、任务及原理
实验目的：掌握蛋白质两性性质和胶体的有关特性。
实验任务：学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。
实验原理：牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
三、实验的拓展(由本实验的完成深化和延伸所学的知识，启发学生利用现有的设备拓展出新的实验内容,培养学生的创新思维和创新能力。
)牛奶中制备酪蛋白→牛奶纯度检测→食品检测。
四、介绍主要仪器设备与使用
（一）材料：新鲜牛奶
（二）试剂
1、95%乙醇1200mL
2、无水乙醚1200mL
3、0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液300ml
先配A液与B液
A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。
B液（0.2mol/L醋酸溶液）：称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。
取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。
4、乙醇-乙醚混合液
乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）
（三）器具：离心机、抽滤装置（布氏漏斗）、精密pH试纸或酸度计、电炉、烧杯、
温度计
五、强调实验中要注意的问题
1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。
最好用酸度计测定。
2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。
3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。
六、学生实验
（一）酪蛋白的粗提
100mL牛奶加热至40℃。
在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL，
用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心15分钟（3000 r /min）。
弃去清液，得酪蛋白粗制品。
（二）酪蛋白的纯化
1、用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。
2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。
最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
3、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品。
（三）准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%）
式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。
