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大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天：1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐?5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次)7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12. 离心，弃上清液13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上)6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天：1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐?5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次)7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。
![大肠杆菌感受态细胞的制备和转__[1]...](https://img.taocdn.com/s1/m/4fcd6260011ca300a7c39002.png)
大肠杆菌感受态细胞的制备步骤：
1．划线，出单菌落。
2．挑取单菌落，接种于5ml psI液体培养基中（试管），37℃振荡培养12h左右，直至对数生长后期。
3．转接，取菌悬液以1%的比例接种于100ml psI液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600=0.5左右。
4．OD值达到后，取下摇瓶冰上放置20min。
5．将培养液转入50ml离心管中，4℃，5000rpm，离心10min。
6．弃上清，用0.4倍体积冰冷的溶液I轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下5000rpm 离心10min。
7．弃上清，加入0.04倍体积的溶液II，轻轻悬浮细胞，冰上放置15min，即成感受态细胞悬液。
8．感受态细胞分装成100μl的小份，贮存于-80℃。
溶液与试剂
1.psI培养基配制：
酵母提取物5g，胰蛋白胨20g，MgSO4 7H2O 5g，定容至1000ml，用KOH调pH=7.6 2.溶液I配制：
将5g RbCl，1M KAc 12.3ml，1M CaCl2 4.1ml，1M MnCl2 20.5ml，61.5ml甘油混匀，用0.1M乙酸调pH=5.8，加水定容至410ml。
过滤除菌。
3.溶液II配制：
将1M Mops 1.5ml，1M CaCl2 11.25ml，1M RbCl 1.5ml，22.5ml甘油混合均匀后，1M KOH 调pH=6.5，加超纯水定容至150ml，过滤除菌。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA.转化(Transformation是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ,它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl等化学试剂法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl法,RbCl(KCl法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年,因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素:1. 细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同,这时比较合适。
大肠杆菌感受态的制备(1)取出保存在-80℃的甘油菌种，取1μl接种在1mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜；(3)按照1：100的比例转瓶于50 mL LB液体培养基。
37℃剧烈震荡；(4)待菌生长到对数中期OD600=0.4~0.6，约需要几小时，然后将菌液转入50 mL无菌离心管中，在冰上放置15分钟，待菌液冷却后于4℃、8,000rpm离心4分钟，收集菌体，弃去培养液；(5)在沉淀中加入O.1M预冷的CaCl2 20 mL，洗涤重悬菌体，离心收集，弃去上清液；(6)加入0.1M CaCl2(冰上预冷)2mL重悬菌体。
置于冰上，48小时内均可使用，12小时后大肠杆菌感受态细胞效率将提高3~4倍；加入0.5 mL无菌甘油使其终浓度为20％(v/v)，以每管100μl分装于1.5mL无菌离心管中，-80℃保存待用。
大肠杆菌的转化1)将从-80℃冰箱中取出的200μl感受态细胞放在冰上融化。
2)加入5-10μl的质粒或连接产物，轻轻混匀内容物，冰浴30min。
3)将EP管迅速放入42℃的水浴中热激2min。
4)快速将EP管转移到0℃冰浴中，使细胞冷却2min。
5)每管加入800μl SOC活化培养基，37℃，180r/min摇床培养1h。
6)最后离心2min，将菌体涂布于LB+抗生素的平板上，将平板置于室温直至液体被吸收。
倒置平板，于37℃培养，12～16h左右可出现菌落。
农杆菌8的菌株活化与感受态的制备(1)取出保存在-80℃的C58甘油菌种，取1μl接种在1mL LB液体培养基中，28℃，200rpm培养过夜；(2)按照1:100的比例转瓶于50 mL LB液体培养基，LB培养基中加50mg/L的硫酸庆大霉素。
28℃200rpm震荡培养过夜；(3)等OD600为0.4~0.6时停止培养，约需8h左右；(4)将菌液转入50mL无菌离心管中，在冰上放置30分钟，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。
大肠杆菌感受态细胞制备实验材料实验器材：1.5ml 无菌EP管，无菌枪头，4℃离心机，恒温摇床，15/50 ml 无菌离心管实验试剂：碧云天一步法感受态细菌制备试剂盒（货号D00301），LB培养基，无抗性琼脂糖培养板实验步骤：1.涂平板：为取得最佳的感受态效率，必须先把甘油菌或其它形式保存的菌种涂LB平板（无抗性），并培养过夜；2.接种：取新鲜培养菌种的LB平板，从平板上挑取一个单克隆，然后把蘸有菌种的塑料枪头或牙签放到装有3毫升LB的细菌培养管内；3.培养：37℃约190-210rpm培养过夜，通常培养时间控制在16小时左右为宜，绝对不宜超过18小时；4.再接种培养：根据需要制备的感受态细菌的量，按照1:100的比例用新鲜培养的过夜菌接种培养。
例如取500微升的新鲜过夜菌到50毫升的LB中继续37℃200rpm培养。
通常在大约培养2-2.5小时后OD600可以达到0.3-0.5；5.制备感受态细菌：在培养的细菌OD600达到0.3-0.5时，4℃2000g离心5分钟收集细菌。
如果离心沉淀前的菌量为50毫升，按后续操作进行，如果是其它体积则按比例换算后进行后续操作。
用5毫升预冷的LB重新悬浮起细菌沉淀，加入5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受态制备试剂，混匀，冰浴放置5分钟。
然后再轻轻混匀，根据实验需要适当分装到1.5毫升或0.5毫升的离心管内-80℃保存。
注意事项：1.需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养和感受态效率的检测；2.尽管处于对数期内的细菌都可以用于感受态细菌的制备，但如果细菌生长的OD600的值达到0.3-0.5左右时，制备出来的感受态效果最佳；3.在制备感受态细菌的过程中均使用不含抗生素的LB。
在使用感受态菌的过程中热休克后的37℃培养时也必须使用无抗生素的LB，即便转入的质粒是有抗性的；4.实验全程在冰上操作可以提高感受态细菌制备效率。
感受态细胞的制备（氯化钙法）（1）将-80℃保存的DH-5α进行活化，在LB固体培养基平板上划线，平板倒置于37℃恒温箱中，过夜培养12-16h；（2）从平板上挑取单菌落接种于5ml液体LB试管培养基中，37℃震荡培养过夜；（3）按照1%~5%的比例将种子菌液接种于100ml新鲜的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.4~0.6(一般按照2%的接种量培养3h即可)后放置于冰上使其冷却以终止其快速生长；（4）将菌液转入50ml离心管中，在冰上放置10min，于4℃低温离心机以6000rpm/min的速度离心10min，收集菌液；（5）弃上清，加入1/10体积（10ml）预冷的感受态制备A液，用移液枪轻轻吹打使菌体重新悬浮，谨记吹打过程中给切忌用力过大以免破坏菌体，并冰浴10min；（6）冰浴后再次于4℃离心机中以6000rpm/min离心10min，弃上清在冰上加入2mlB液重悬菌体，最后按照100ul/cell分装，取100ul进行转化实验，检测其转化效率，剩余的放置在-80℃低温冰箱保存，半年之内可用，超过后转化效率会有所下降。
大肠杆菌感受态细胞的制备 标签： tr..,Ca..,co.. 分类： 细胞技术 > 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的 CaCl2 法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经 CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。
在自然条件下， 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内， 但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。 如需将质粒载体转移进受体细菌， 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，摄取外源 DNA 。 以
转化（ Transformation ）是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种 手段， 它是微生物遗传、 分子遗传、 基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的 受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 （R-,M- ），它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些 特殊方法（如电击法， CaCl2 ，RbCl(KCl) 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生 了暂时性的改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞 （ Compenent cells ）。进入 受体细胞的 DNA 分子通过复制、 表达实现遗传信息的转移， 使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（ Transformant ，即带有异 源 DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl) 法， RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，但 CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可 以满足一般实验的要求， 制备出的感受态细胞暂时不用时， 可加入占总体积 15%的无菌甘油 于-70 ℃保存（半年），因此 CaCl2 法使用更广泛。
主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2 溶液
(2)LB 液体培养基 (3)30% 甘油： 30mL 甘油溶于 100mL 蒸馏水，高压灭菌。
主要设备 (1) 超净工作台 (2) 冷冻离心机 (3) 恒温摇床 (4) － 70 ℃冰箱 (5)10mL 移液管
(6) 吸耳球 (7)1mL 、200 μL移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管
(9)1.5mL 离心管
实验材料 (1) 大肠杆菌 DH5α （R- ， M- ， Amp- ） 实验步骤 （一）受体菌的培养 (1) 从 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5 α菌落，接种于单 3～ 5mL LB 液体培养基中， 37 ℃
下振荡培养过夜（ 12h 左右）。 (2) 将该菌种悬液以 1:100 的比例接种， 取 250 μL菌液转接到 25mL LB 液体培养基中， 37 ℃
振荡培养 2～ 3h 至 OD600 ＝ 0.5 左右。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。） (1) 将菌液转入 50mL 离心管中，冰上放置 10min 。 (2) 在 4 ℃下， 4000r/min 离心 10min 。弃去上清，将管倒置 1min 以便培养液流尽。 (3) 用冰上预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液 10mL 轻轻悬浮细胞，冰上放置 30min 。 (4)0 ～ 4℃ 4000r/min 离心 10min ，弃去上清，加入 2mL 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液，
轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。 （注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制 备）
（三）感受态细胞的分装与冻存 (1) 在 2mL 制备好的感受态细胞中加入 2mL30% 甘油（即 1:1 体积，甘油终浓度 15%）。
(2) 将此感受态细胞分装成每份 200 μ L (1.5mL dorf 管 )，液氮速冻，快速转入 -70 ℃冰箱保 存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入 -70 ℃冰箱保存。） 注意事项 ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从 -70 ℃或 -20 ℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 经
过多次转接， 及贮存在 4 ℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在 5×107 个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的 OD600 控制。对 TG1 菌株， OD600 为 0 ． 5 时，细胞密度在 5×107 个 /ml 左右。（应注意 OD600 值与细 胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。 此外，受体 细胞一般应是限制 -修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并 且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、试剂的质量 所用的 CaCl2 等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于 4 ℃。 ⑶、防止杂菌和杂 DNA 的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿， 如离心管， 移液枪头等最好是新的， 并经 高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、 DNA 酶或杂 DNA 所污染， 否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入。 ⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
人人都爱 protocol 。。。。 蛋白的纯化 1.菌液离心
取出三角瓶 ,倒入离心管中 ,离心 (6000rpm,10min,4 ℃ ),离心之后 ,倒去上清 .
2.细胞重悬 加上 2mL 的 lysis buffer 洗沉淀 ,重悬细胞 .
lysis buffer 配方是 HEPES (2M,PH 7.0)200 μNacll, (4M) 500 μ l,DTT 3 μ l,Brij 100 μ l, PMSF 200 μ l,H2O 19ml,共 20ml 体系 .
3.初步溶解 加入溶菌酶 20μl（ 100mg/ml ）于重悬液中 ,然后冰浴 20min. 再用 1.5ml EP 管分装 .
4.冷冻 将分装后的菌体放入 -80 ℃冰箱里冷冻约 20min （或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后 , 取 出待其融化。 5.细胞破碎
融化之后破碎细胞 ,用超声波细胞粉碎机破碎 ,每次 10s, interval 20s, 20 次 .若量大可用压榨
机来破碎 . 6.离心 离心细胞破碎液 ,12500rpm,1h,4 ℃ ,然后收集上清并转另一个 1.5ml 管 ,再加 100μl 1M Tris
-HCl buffer(PH 8.0)到上清中。（碱性有利于蛋白的获得）可以先放 -80.
7.纯化上清 ⑴ 准备 Ni 柱 在试管中加上空柱 ,缓慢滴加 300μl的 Ni 柱于空柱中 ,待其完全沉淀（每 300μl树脂液中有 5%Ni-NTA agnose ）。再用 2ml 的 AT buffer 平衡柱子（大约 1h ）。 AT buffer 配方： Tris- HCl 1M PH8.0 1000 μ l,NaCl 4M 1000 μ l,Brij 20 μ l,DTT 3 μ l, H2O 18ml. ⑵ 上样 加 2ml 上清到 Ni 柱中 ,并用 2ml AT buffer 冲洗 .(注意缓慢滴加 ) ⑶ 洗脱样品 加上 1ml 的 salt washing buffer 冲洗 ,其配方是 AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100 μl.
再加上 1ml 的 Imidazole buffer （ AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml ）冲洗 ,洗去非特 异性蛋白。 ⑷ 再洗脱目的蛋白
用 300μl的 Elution buffer 冲洗 ,获得所需的特异性蛋白 . Elution buffer 配方： AT buffer
7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml. 8.纯化细胞破碎液的沉淀 用 urea buffer 重悬细胞沉淀 , 在常温温育 1h, 再离心 (12500rpm 1h 4 ℃),收集上清 ,重复上 清纯化步骤 .urea buffer 的配方是 Tris- HCl 1M PH8.0 1000 μl,NaCl 4M 1000 μl, Brij 20 μl, DTT 3 μ l, urea 8M 18ml. 其余 buffer 均用 urea buffer 来配置 .
9.SDS-PAGE 的鉴定 ⑴配胶 (根据此蛋白的大小（ 55KD ） ,配置 12% 的胶 ) 下 层 胶 的 配 方 :Acr/Bis 4.44ml, 下 层 胶 缓 冲 液 PH8.8 3.75ml,TEMED7 μ l,10%APS75 μ l,ddH2O6.8ml.
上 层 胶 的 配 方 是 : Acr/Bis0.75ml, 上 层 胶 缓 冲 液 PH6.8 1.5ml,TEMED
4 μ l,10%APS37.5 μ l,ddH2O3.75ml.
⑵配置样品 每管加样品 2μl,5 ×loading buffer 4 μ再l,加 ddH2O 补全 20μl体系 . 混合好 loading buffer
和样品后 ,在 100 ℃下煮约 5min, 然后置室温下冷却后上样。 样品 1 ：纯化上清；样品 2 ：纯化沉淀；
对照 1 ：未纯化上清；对照 2 ：未纯化沉淀；对照 3 ：标准甘油激酶
⑶上样 添加样品 ,上样 20μl,同时加上 Marker,10 μl. ⑷电泳 加上足够的电泳缓冲液 (1 ×),要加在两板内外 ,一定要浸没过板 ,形成电流通路 .调好电压进行
电泳 ,约 1h 后 ,loading buffer 条带跑到底 ,便可停止 .
⑸考马斯亮蓝染色 ① 将电泳后的 PAGE 胶取下放入容器中 ,加入 50ml 双蒸水或去离子 水 ,加热至沸腾后停止 ,
继续在脱色摇床上摇动 5min, 弃去水溶液 . ② 加上染色液 ,以浸没胶面为准 ,加热沸腾后保持状态 30-60s, 停止加热后继续在脱色摇床 上摇动 10min, 弃去染色液 . ③ 加入约 50ml 的水 , 再加热至沸腾后保持沸腾状态 30-60s, 停止加热后在摇床上要 5-10min, 换水可完成脱色 .
