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流式细胞仪分析技术及应用

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流式细胞仪分析技术及应用一、选择题（一）A1型题（标准型）1．流式细胞仪是由下述哪项基本结构组成A．流体系统B．光学系统C．计算机系统D．流体系统、光学系统和信号处理系统E．流体系统、光学与信号转换测试系统和信号处理与放大的计算机系统2．流式细胞仪流动池鞘液孔径通常为A．50μmB．50～100μmC．50～200μmD．50～300μmE．300μm3．关于液流系统的鞘液，下述哪项是正确的A．鞘液是辅助样本作正常检测的基质液B．鞘液是用来与样本作对比的C．鞘液是包裹在样本流周围D．使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确性E．防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞4．流式细胞仪光学系统的组成为A．激光系统B．激光光源与分光镜C．激光光源、分光镜与光束成形器D．激光光源、分光镜、光束成形器和透镜组E．激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管5．下述哪项关于激光光源的叙述是正确的A．采用气冷式氩离子激光器B．激光波长488nm，15mWC．激光束波长466 nm，10mWD．不散焦E．容易聚焦成有高斯能量分布的光斑6．光束成形器的作用是将激光器发射的激光束聚焦成A．高15μm、宽57μm的椭圆形光斑B．高10μm、宽57μm的椭圆形光斑C．高15μm、宽50μm的椭圆形光斑D．高10μm、宽50μm的椭圆形光斑E．高20μm、宽60μm的椭圆形光斑7．反射较长波长的光而通过较短波长的光的是A．气冷氩离子激光器B．分色反光镜C．光束成形器D．透镜组E．光电信增管8．检测荧光和反射光，并将光学信号转换成电脉冲信号的是A．气冷氩离子激光器B．分色反光镜C．光束成形器D．光电倍增管E．透镜组9．流式细胞仪组成部件中对实验分析数据存储、显示与分析的是A．液流系统B．光学系统C．光电倍增管D．软件E．数据处理系统10．一台好的流式细胞仪每秒钟可测量A．25000个细胞B．20000个细胞C．15000个细胞D．10000个细胞E．5000个细胞11．一台好的流式细胞仪每秒钟可测定荧光染料粒子A．5000个B．4000个C．3000个D．2000个E．1000个12．前向散射光（ＦＳ）信号的强弱与下述哪项成正比A．体积大小B．细胞性状C．颗粒多少D．位移速度E．荧光强弱13．前向散射光是用于检测细胞或其他粒子的A．内部属性B．表面属性C．着染属性D．粒子属性E．以上都不是14．侧向检测器与发射激光束的方向A．平行B．在激光前方C．在激光上方D．垂直E．在激光下方15．侧向散射光（ＳＳ）用于检测细胞的A．表面属性B．内部结构属性C．着染属性D．物理属性E．化学属性16．荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受A．荧光激发后产生B．紫外光激发产生C．红外光激发产生D．发光物质激发产生E．激光激发产生17．流式细胞仪检测原理中最重要的一点是A．检测荧光的特定发射波长B．检测激发光的波长C．检测荧光的颜色D．检测前向散射光E．检测侧向散射光18．对数放大器中输入信号放大10倍，输出信号放大A．1倍B．2倍C．3倍D．10倍E．100倍19．对数放大器中输入信号放大10倍，输出信号由A．1转变为2B．2转变为3C．3转变为4D．1转变为3E．1转变为420．线性放大器用于测量的信号A．强度变化范围较广B．放大倍数较大C．放大倍数较小D．强度变化范围较少E．以上都不是21．对数放大器用于测量信号是A．强度变化大但信号简单B．强度变化小但信号复杂C．强度变化大且信号复杂D．强度变化小且信号简单E．以上都不是22．流式细胞仪中最常用于单抗标记的荧光染料是A．FITC、RB200、TRITCB．FITC、PE、PCC．FITC、RB200、PED．FITC、TRITC、PEE．FITC、PE、ECD或PECY523．消除重叠信号通常采用A．荧光补偿B．滤光片C．调整荧光染料D．线性转换E．对数转换24．分选细胞时液流柱形成液流的速率约每秒钟A．50000个B．40000个C．30000个D．20000个E．10000个25．均匀连串的液滴中大量液滴是A．含有细胞B．含有淋巴细胞C．含被荧光染色的淋巴细胞D．不含细胞的空白液滴E．以上都不是26．待分选细胞形成液滴时会被A．染色B．充电C．酶标记D．抗体捕捉E．以上都不是27．带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场后会A．聚集B．散开C．继续下落D．停止下落E．向左或右偏转28．一般要求分选速度至少达到A．20000个/秒B．10000个/秒C．7000个/秒D．5000个/秒E．3000个/秒29．分选速度与细胞悬液中分选细胞的下述哪项直接相关A．细胞含量B．细胞性质C．细胞大小D．有否胞膜E．单核或多核30．骨髓来源细胞的分选宜选择高速是因为A．细胞太多B．细胞太大C．细胞膜坚固D．细胞核坚固E．在总细胞群体中所占比例不高31．分选纯度除与仪器的精密度相关外，还与A．被分选细胞的性质相关B．其他细胞的性质相关C．被分选细胞的数量相关D．其他细胞的数量相关E．分选细胞与其他细胞有无相互重叠相关32．要想取得分选高收获率，就应A．提高被分选细胞的纯度B．降低被分选细胞的纯度C．提高被分选细胞的浓度D．降低被分选细胞的浓度E．降低其他细胞的浓度33．现在设置收获率均在A．100%B．99%以上C．98%以上D．95%以上E．90%以上34．分选得率是指A．分选收获率B．通过测量点的分选细胞的比率C．从悬液中分辨出的目的细胞的总量D．通过测量点的细胞与实际收获的分选细胞的比率E．从悬液中分辨出的目的细胞总量，再经分选后获得的实际比率35．分选得率与A．分选速度相关B．分选目的细胞总量相关C．不选细胞总量相关D．分选细胞的生物学性质E．不选细胞的生物学性质36．面积脉冲信号是指A．电压脉冲曲线内外区域的大小B．电压脉冲曲线外区域的大小C．电压脉冲曲线内区域的大小D．电压脉冲的高度E．以上都不是37．流式细胞仪的数据参数中荧光信号反映的是A．颗粒中被染上荧光部分数量的多少B．颗粒的大小C．细胞内部结构复杂程度D．细胞表面的光滑程度E．以上都不是38．单参数直方图反映的是A．不同荧光强度的颗粒数量B．同样荧光强度的颗粒数量C．不同荧光强度的颗粒性质D．同样荧光强度的颗粒性质E．以上都不是39．单参数直方图中A．纵坐标表示被测细胞的数量，横坐标分为1024脉冲信号通道B．纵坐标表示被测细胞的性质，横坐标分为1024测量参数C．纵坐标表示被测细胞的数量，横坐标分为1124测量参数D．纵坐标表示被测细胞的性质，横坐标分为1024脉冲信号通道E．纵坐标表示被测细胞的数量，横坐标分为1024细胞40．双参数直方图包括A．点图B．点图、二维等高图C．点图、二维等高图、三维等高图D．点图、二维等高图、假三维等高图E．点图、二维、三维和假三维等高图41．等高线图由类似地图上的下述哪种线组成A．实线B．虚线C．连线D．双线E．等高线42．假三维等高图中的一维不是参数，而是A．细胞B．细胞数C．线性D．对数E．峰值43．Regiou设置是根据下述哪项信号强弱划定分析区域A．同一张单参数和三参数直方图B．同一张双参数和三参数直方图C．同一张单参数和双参数直方图D．同一张单参数和多参数直方图E．同一张双参数和多参数直方图44．gate设置是指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定待分析的特定细胞群，并要求该样其他参数组合的直方图只体现A．该群细胞的分布情况B．ＲBC的分布情况C．ＷBC分布情况D．Pt分布情况E．CD4+细胞分布情况45．进行流式细胞分析第一步是制备A．两个细胞的重叠B．多个细胞的粘连C．细胞碎片D．单细胞悬液E．细胞荧光染色46．制备单细胞悬液时，测定前通常要把哪项从血液中分离出来A．单核细胞或淋巴细胞B．单核细胞或血小板C．淋巴细胞或血小板D．Ｔ淋巴细胞或B淋巴细胞E．红细胞或血小板47．从新鲜实体组织制备单细胞悬液的目的是A．分离细胞B．不损伤细胞C．既分离细胞又不损伤细胞D．破坏组织间的胶原纤维E．分解组织间的蛋白质48．新鲜实体组织单细胞悬液制备的常用方法有A．机械法B．酶处理法C．化学试剂处理法D．表面活性剂处理法E．以上都不是(二)A2型题(否定型)1．流式细胞仪分析技术不包括A．激光技术B．计算机技术C．电子显微镜技术D．流体喷射技术E．分子生物学技术2．不是带通滤片允许通过的光波长是A．525 nmBPB．575 nmBPC．620 nmBPD．625 nmBPE．675 nmBP3．与散射光的强弱无关的是A．细胞的大小B．细胞的形状C．细胞的标记D．细胞的光学同性E．胞内颗粒折射4．荧光染料在488nm激发光下发出荧光颜色错误的是A．绿色B．橙色C．白色D．橙红色E．红色5．对培养细胞的分选不宜选择高速，是因为A．细胞太多B．细胞太大C．细胞膜脆弱D．细胞核脆弱E．胞浆所占比例大6．不是流式细胞仪数据显示的方式是A．单参数直方图B．双参数直方图C．三参数直方图D．假三维等高图E．前向散射光示意图（三）B1型题（配伍题）问题1～3A．量子产额和消光系数B．吸收C．波长差D．标记染色E．荧光信号1．荧光染料应有较高的：2．发射光波长与激发光波间有较大的：3．荧光染料对488nm激发光波长有强的：问题4～6A．深蓝B．橙红色C．橙色D．红色E．深红色4．FITC的荧光颜色是：5．PE（RD1）的荧光颜色是：6．ＰeCy7的荧光颜色是：问题7～9A．CD3+、CD4+、CD8-B．CD3+、CD4+、CD8+C．CD19、CD20、CD21、CD22D．CD16、CD56、CD11a/CD18E．CD3-、CD16+、CD56+7．临床确定为ＮＫ细胞的是：8．成熟B细胞主要表达的是：9．Ｔh细胞表达的是：问题10～12A．ＴdＴB．ＰＩC．ＭDＲD．CD4+/CD8+倒置E．ＨＬA－B2710．用流式细胞仪检测的胞质内抗原之一是：11．用于肿瘤耐药基因分析时，可检测到的是：12．AIDS患者免疫诊断指标之一是：二、填空题1．血液中各类细胞的密度不同，其中____________与Ｆicoll分层液密度1.077相当，离心后位于分层液与血浆层的界面中。

2．FITC是免疫荧光技术中最常用的染料，但其发射荧光的强度受影响较大。

3．两种荧光发射信号重叠时，其检测准确性差，通常采用的方法来消除重叠信号。

4．细胞仪根据细胞流经光照射区时＿＿＿＿＿＿的强弱来分析和分选细胞。

5．式细胞术是对的理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

三、判断题1．流式细胞仪的工作原理借鉴了荧光显微镜技术。

2．镜组的作用是将激光和荧光变成平行光。

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利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS

利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS

利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS 流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，可用于分析细胞数量、形态、存活率、细胞周期等多个参数。

下面将详细介绍如何利用流式细胞仪来分析细胞存活率、细胞周期和ROS （Reactive Oxygen Species）。

一、分析细胞存活率细胞存活率是研究细胞毒性或细胞凋亡过程中的重要参数。

在流式细胞仪中，常用细胞染色剂PI（Propidium Iodide）来评估细胞的存活率。

PI是一种能够穿透破损细胞膜并结合DNA的染色剂，可以通过荧光检测器来测量。

具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。

可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。

2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。

3.加入适量的PI染色剂到细胞悬浮液中，一般终浓度为1-10μg/mL。

4.在黑暗条件下，在4°C冷藏室中孵育15-30分钟，避免光照和温度升高。

5.使用流式细胞仪进行测量。

设置PI染色剂的激发波长和检测通道，根据实验需要选择适当的过滤器。

6. 将细胞悬浮液转移到流式细胞仪的样本管中，进行数据采集和分析。

可以设置门控（gating）策略以排除细胞碎片和颗粒物。

通过分析样本中PI染色的细胞数量，可以计算出细胞的存活率。

二、分析细胞周期细胞周期分析是研究细胞增殖和凋亡机制的一项重要实验。

在流式细胞仪中，通过DNA染色剂染色和分析可以了解细胞的周期分布情况。

具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。

可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。

2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。

3.用酒精或细胞固定液固定细胞，一般在-20°C的环境中固定20-30分钟。

流式细胞仪分析技术及应用

流式细胞仪分析技术及应用


〔一〕流式细胞仪的根本组成结构：
〔1〕 液流系统 〔2〕 光学系统 〔3〕 数据处理系统
〔1〕液流系统
• 由样本和鞘液组成
• 待测细胞
单个细胞的悬液
荧光染料标记的单抗对其染色
受清洁气体压力
从样品管进入流动室形成样本流
• 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围， 保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在 一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染 料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料 产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。
能量传递复合染料机制
488nm
575nm CY5
PE
CY5
藻红蛋白
CY5
花青苷5
670nm 红色荧光
〔二〕免疫荧光标记
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
〔二〕分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正 比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 • 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及 功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取 多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
流式细胞术开展史
• 1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究 • 1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用

FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用

流式细胞术的概念
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞仪分析技术及应用

流式细胞仪分析技术及应用

流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。

概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。

一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。

待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。

2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。

（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。

（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。

（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。

（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。

（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。

（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。

3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。

二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。