流式细胞仪的应用

安徽农学通报，Ａｎｈｕｉ　Ａ　．Ｓｃｉ．Ｂｕｌ１．２００６，１２（１２）：３９—４１　

流式细胞仪　

赵　泓　刘　凡　

（北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京１０００９７）　

摘要：随着科技水平的不断深入，科研设备的不断更新，国家对科研投入的不断增多，植物检测技术也得到了进一　

步的发展。流式细胞仪植物检测技术是近几年在我国刚刚兴起的一项新技术，对许多植物科技工作者来说还比较陌　

生。本文用比较通俗的语言介绍了进行流式细胞仪分析所必须的基本概念、发展历史、工作原理、知名品牌、常见型　

号及其在植物上的应用。　

关键词：流式细胞仪；植物；检测技术　

中图分类号Ｃ３４３　文献标识码Ａ　文章编号１００７—７７３１（２００６）ｌ２—３９一Ｏ３　

Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｚｈａｏ　Ｈｏｎｇ（Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｅｒｉｎｇ　１０００８９，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｃｉｅｎｃｅ，ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｕｐｄａｔｉｎｇ　ｏｆ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ，ａｎｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔ　ｂｙ　ｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｍａｄｅ　ｇｒｅａｔ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ．Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）ｉｓ　ａ　ｎｅｗ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｐｐｅａｒｅｄ　ｒｅｃｅｎｔｌｙ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ．Ｉｔ　ｉｓ　ｓｔｉｌｌ　ｓｔｒａｎｇｅ　ｔｏ　ｍａｎｙ　ｐｌａｎｔ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ａｒｔｉｃｌｅ　ｗｅ　ｂｒｉｅｆｌｙ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｂａｓ—　ｉｃ　ｃｏｎｃｅｐｔ　ａｎｄ　ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　ＦＣＭ，ｓｉｍｐｌｙ　ｅｘｐｌｍｎ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ｃｏｎｃｒｅｔｅｌｙ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｔｈｒｅｅ　ｆａｍｏｕｓ　ｃｏｍｐａｎｉｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｍｏｄｅｌＴｌ　ｍｏｄｅｌｓ，ａｎｄ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ　ｓｏｍｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＦＣＭ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｓｃｉｅｎｃｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；ｐｌａｎｔ；ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　

流式细胞仪的原理与使用

一、定义

流式细胞仪（flow cytometer）：是集光电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学、单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。

流式细胞术（flow cytometry , FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识及技术。

二、基本结构

1.流动室和液流系统

流动室由样品管、鞘液管、喷嘴等组成，由透明稳定的材料（化学玻璃、石英等）制成，是液流系统的核心部分。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力下从样品管射出。鞘液由鞘液管由四周流向喷孔，包围在样品外周后由喷嘴射出。

2.激光源和光学系统

光源根据被激发物质的激发光谱而定，常用弧光灯和激光。常用的弧光灯为汞灯，激光器多为氩离子激光器、氪离子激光器或染料激光器。经过特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发荧光供收集检测。

3.光电管和检测系统

荧光染色或荧光标记后的细胞受到合适的光激发后产生的荧光通过光电转换器转变为电信号进行测量。通常使用光电倍增管（PMT）。PMT响应时间短，为ns数量级，具有较强光谱响应特性，200～900nm光谱区内光量子产额较高，其增益从103到108可连续调节，有利于弱光的测量。

由PMT输出的电信号放大后输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类为线性放大器，即输出信号辐度与输入信号成线性关系，适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。免疫分析时需要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，其荧光强度相差1～2个数量级；在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。

流式细胞术简介

一、流式细胞术发展简史

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。

概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。

1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。

1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。

反应不强烈,不典型胃十二指肠溃疡急性穿孔混淆;急性阑尾炎,溃疡穿孔后,消化液沿右结肠旁沟流到右下腹,引起右下腹痛和腹膜炎,易与急性阑尾炎混淆[6],发生误诊误治。利用人工󰀁气胃󰀁方法,使胃十二指肠溃疡急性穿孔患者X线检查右膈下出现游离气体,可避免与上述疾病误诊。2󰀁3󰀁亚急性穿孔󰀁穿孔前已与邻近的组织脏器粘连,不适宜此方法鉴别。总之,人工󰀁气胃󰀁方法应用于胃十二指肠溃疡急性穿孔鉴别诊断中是一种简单易行,效果良好的方法,特别对临床工作经验不丰富的年轻医师,在临床工作中会起到很大的帮助,可减少或避免发生误诊、误治。参󰀁考󰀁文󰀁献[1]󰀁韩积义,崔自介.腹部外科诊断和鉴别诊断学.人民卫生出版社,2001:205󰀁206.[2]󰀁陈孝平.外科学.人民卫生出版社,2002:561.[3]󰀁裘法祖,孟承伟.外科学.人民卫生出版社,1985:417.流式细胞仪的工作原理及应用李超󰀁韩金路󰀁王玉刚󰀁孙英凯󰀁摘要󰀁󰀁流式细胞仪(flowcytometer)是一种在功能水平上对单个细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测仪器。本文就流式细胞仪的原理及在医学上的应用进行了一定分析。󰀁关键词󰀁󰀁流式细胞仪;流式细胞术;工作原理

󰀁󰀁作者单位:164092北安,黑龙江省第三医院(李超󰀁王玉刚󰀁孙英凯);海伦市人民医院(韩金路)󰀁󰀁流式细胞术(flowcytometry)也称荧光激活细胞分类术,是上个世纪70年代初发展起来的一项高新技术,80年代初研制出了稳定性能良好的流式细胞仪,开始应用到临床医学研究及疾病的诊断和监测,目前流式细胞仪已广泛应用于生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、病理学、临床检验等领域。1󰀁流式细胞仪的主要原理流式细胞仪主要由以下五部分构成:󰀁流动室及液流驱动系统;󰀁激光光源及光束形成系统;󰀁光学系统;󰀁信号检测与存储、显示、分析系统;󰀁细胞分选系统。流动室是流式细胞仪的核心部件,由石英玻璃制成。单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22󰀁m󰀁66󰀁m),使通过激光检测区的细胞受照强度一致。流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔的将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰;流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷,当液滴流经带有几千伏特的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,不予充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。2󰀁流式细胞仪的应用2󰀁1󰀁在肿瘤学方面的应用󰀁流式细胞仪通过对细胞内DNA含量的测定,进行早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作,对癌前病变的性质和发展趋势作出判断,有助于癌变的早期诊断[1]。DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术,对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。异倍体肿瘤恶性病变的复发率、转移率及死亡率均较高,流式细胞仪不仅可以对异倍体恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。2󰀁2󰀁在血液学方面的应用󰀁人们越来越多的发现,在临床血液学实验室中,流式细胞术被用于白血病及淋巴瘤诊断的系列识别。借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数,可以提高白血病分类诊断的符合率,其诊断的准确性可达到90%左右,较形态学检查准确性提高10%~20%[2]。随着6󰀁色或8󰀁色流式细胞仪的出现,分析变得更加复杂,然而多色分析的准确性和精确性却给临床医生在诊断及管理这些疾病时提供了更多的信心,并使得这些患者能够得到更好的针对治疗。2󰀁3󰀁在免疫学方面的应用󰀁由于流式细胞术可以进行高灵敏度、高速度和多参数分析,使流式细胞术对血液淋巴细胞亚群的检测较其他方法更精确。通过淋巴细胞及其亚群数量的检测,可了解在不同情况下机体的免疫功能状态,辅助临床疾病的诊断,探索疾病的发病机理、病程、预后,指导临床治疗方案[3]。随着免疫学和遗传学及流式细胞仪检测技术的发展,由开始的主要采用间接免疫荧光标记法到直接免疫荧光标记法,从单色或双色到利用CD45抗体标记设门法进行多色免疫标记。利用造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高度相关性,可以精确地将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞群完全分开。2󰀁4󰀁流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用󰀁细胞凋亡是机体生长发育、细菌分化和病理状态中细胞死亡的过程,凋亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离,细胞质浓缩,细胞膜和󰀁235󰀁中国实用医药2009年7月第4卷第20期󰀁ChinaPracMed,Jul2009,Vo.l4,No.20核膜皱曲,核断裂形成片段,最后形成数量不等的凋亡小体。流式细胞术可以进行DNA含量分析,通过二倍体细胞G0/G1期峰前的亚二倍体峰来确定。在凋亡早期,一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定表达,通过FCM结合单克隆体可以检测表达这些蛋白的细胞,从而确定细胞的凋亡情况。流式细胞仪发明的初期,主要应用在对细胞的分选上,随着计算机技术、免疫学的发展以及单克隆抗体技术的发明,随后才在生物学和医学、药学等领域的应用越来越广泛。可以相信,在未来生物医学学领域,流式细胞仪的应用范围会进一步扩大,应用深度会进一步加强。参󰀁考󰀁文󰀁献[1]󰀁农乐根.流式细胞术的工作原理及临床应用.右江医学,2005,33(3):301󰀁303.[2]󰀁徐兵,胡成,缪旭东,等.106例成人急性白血病流式细胞术免疫分型分析.第一军医大学学报,2003,23(10):1043󰀁1046.[3]󰀁KrupnickAS,KreiselD,SzetoWY。eta.lMultiparameterflowcy󰀁tometricapproachforsimultaneousevaluationofTlymphocyte󰀁endo󰀁thelialcellinteractions.Cytometry,2001,46(5)t271󰀁280.谈谈小儿头皮静脉留置针的穿刺技巧鄢利芳󰀁朱玉珍󰀁黄登柱󰀁关键词󰀁󰀁密闭式静脉留置针;头皮静脉血管;针头的固定󰀁󰀁密闭式静脉留置针又称套管针,是临床输液、输血、静脉内营养支持给药的重要工具,正确使用密闭式静脉留置针将成为儿科护士的基本技能,我们在日常工作中,通过不断探索和实践,基本掌握了使用小儿头皮静脉留置针的穿刺技巧,现报告如下。1󰀁留置针的选择一般选用Y型0󰀁7mm󰀁19mm(24G󰀁0󰀁75󰀁)[YZB/国0052󰀁2005Q/320500BD007]型密闭式静脉留置针。2󰀁血管的选择一般选择粗而直、且皮下组织稍丰富的血管。额正中静脉粗而固定,但皮下组织少,在推管过程中阻力较大,易刺破渗漏而导致穿刺失败。而颞浅静脉粗大直,皮下组织稍丰富,易推管,成功率高,因此我们一般选择颞浅静脉。3󰀁手法3󰀁1󰀁备皮󰀁剃掉穿刺点周围直径6cm左右的头发,以利于透明无菌贴膜的粘贴。3󰀁2󰀁消毒󰀁以穿刺点为中心,用碘伏由内向外消毒皮肤三次,直径约6cm,然后用干棉签用同样的方法擦拭一遍,以改善视野。3󰀁3󰀁进针󰀁针头与皮肤成15󰀁~25󰀁,针头斜面向上,右手持󰀁󰀁作者单位:435500湖北省黄梅县人民医院住鳍状针座,在距血管0󰀁5cm处进针,然后将针头平行刺入血管内。4󰀁针头的固定见导管内有回血后,用左手拇指按住隔离塞,右手拇指将软管顺着血管的走向轻轻用力向前慢推,至软管全部推入血管内,再次证明穿刺成功后即用透明无菌贴膜作密闭式固定导管。同时抽出针芯,用注明置管日期、时间、签名的小胶布再次固定留置针管,将头皮针管盘曲后用胶布固定,必要时再用胶布将患儿头部绕一圈,以防出汗而脱落。5󰀁体会选择密闭式静脉留置针的大小,选择头皮静脉血管的部位是否合适,操作时手法是否恰当,针头固定的好坏,将直接影响静脉穿刺的成功率。日常工作中,我们不但要有饱满的热情,无私的爱心和强烈的责任感,更要有精湛的技术,丰富的经验,我们只有不断提高自身的综合素质,才能在工作中得到不断升华。参󰀁考󰀁文󰀁献[1]󰀁李秀云,邹碧荣.护理技术操作规程及评分标准.湖北科学技术出版社,2005:54󰀁58.[2]󰀁彭裕文.局部解剖学.人民卫生出版社,2006:8󰀁20.糖尿病足的健康教育张小聪󰀁摘要󰀁󰀁目的󰀁探讨预防糖尿病足的自护方法。方法󰀁在糖尿病者及高危人群中,宣传相关知识提高本病的认知水平,学习自我防护的基本方法。󰀁关键词󰀁󰀁糖尿病足;健康教育󰀁󰀁作者单位:474150河南省邓州市中医院护理部󰀁󰀁糖尿病足部改变,又称糖尿病足,是糖尿病患者在合并周围神经,血管病变的基础上,由于足部损伤、感染引起的下肢病变的总称,是糠尿病最常见的并发症之一,也是患者致残、致死的重要原因。笔者在周围血管病专科从事护理工作多年,通过对2002~2008年我科收治的107例患者护理体会及相关情况的了解,对糖尿病足的健康教育的内容总结如下。󰀁236󰀁中国实用医药2009年7月第4卷第20期󰀁ChinaPracMed,Jul2009,Vo.l4,No.20