ELISA实验原理,方法,仪器,流程图和注意事项分析.ppt

优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。
——需制备各种酶标抗原或抗体。
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间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分
为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液
和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检
样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形
成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗
原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色
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ELISA的发展概况
自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免 疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、 简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。
随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使 ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检 测方法之一。
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酶标板
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ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。

它具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊 断、食品安全等领域。
ELISA的原理
酶联免疫吸附测定的基本原理是抗原 -抗体反应，即利用抗原与抗体之间 的特异性结合，实现对目标分子的检 测。
随后加入酶标记的抗体或抗原，与固 相载体上的抗原或抗体发生特异性结 合，形成酶标记的抗原-抗体复合物。
Elisa技术简介
简要介绍Elisa技术的原理、特点、 分类和应用范围，让读者对Elisa技 术有一个初步的了解。
结合图表和图片，形象生动地展示 Elisa技术的操作流程和实验设计，便 于读者理解和记忆。
02
Elisa原理
酶联免疫吸附测定（ELISA）的定义
酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于抗原-抗体反应的检测技术，通过酶标记的 方法，将抗原或抗体结合到固相载体上，实现对目标分子的定量或定性检测。
标准化问题
不同实验室间Elisa检测结果 的标准化问题尚未完全解决，
导致结果可比性不高。
对操作人员要求高
虽然Elisa技术操作简便，但 对操作人员的专业知识和技能
要求较高。
06
Elisa技术的发展趋势和未来展望
技术创新和改进
自动化技术
提高检测的自动化程度，减少人 工操作，提高检测效率。
纳米技术
利用纳米材料提高检测的灵敏度 和特异性，实现更精确的检测。
食品安全检测
食品中微生物检测
检测食品中的细菌、病毒和寄生虫等微生物，确保食品的安全性。
食品中农药残留检测
检测食品中农药残留量，控制食品中的农药污染。
食品添加剂检测
检测食品中的添加剂种类和含量，保证食品的质量和安全。
环境监测
水质监测

拓展ELISA检测技术在生物医学、环境监测 、食品安全等领域的应用，推动相关产业的 发展。
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06 ELISA实验操作技巧与注 意事项
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实验前准备工作建议
01
仔细阅读试剂盒说明书 ，了解实验原理、操作 步骤和注意事项。
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02
准备好所需的试剂、耗 材和仪器，确保它们的 质量和性能符合要求。
去除异常值、缺失值等， 保证数据质量。
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数据转换
对数据进行对数转换、归 一化等处理，以满足后续 分析需求。
统计分析
采用t检验、方差分析等统 计方法，对实验组和对照 组数据进行比较，评估差 异显著性。
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结果解读与报告撰写
结果解读
根据统计分析结果，结合专业知 识对实验数据进行解读，如判断 样品中目标物质的含量是否超标
《elisa检测技术》ppt课件
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目 录
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• ELISA检测技术概述 • ELISA实验方法与步骤 • ELISA实验数据分析与解读 • ELISA技术在生物医学领域应用 • ELISA技术挑战与发展趋势 • ELISA实验操作技巧与注意事项
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01 ELISA检测技术概述
发展多重ELISA检测技术，实现对多个目标物的同时检测，提高检 测效率。
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新型ELISA技术发展趋势
数字化ELISA
利用微流控、微阵列等技术，实现ELISA检测的数字化、自 动化和智能化。
免疫荧光ELISA
结合免疫荧光技术，提高ELISA检测的灵敏度和特异性。
化学发光ELISA

原理
ELISA技术利用抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体结合，再加入酶标记的 抗原或抗体，通过酶催化底物显色反应，实现对目标分子的检测。
ELISA技术的分类和应用
01 间接ELISA
02 夹心ELISA
03 竞争ELISA
04 重组ELISA
05 应用
用于检测抗体，将抗原吸 附在固相载体上，然后加 入待测血清，最后加入酶 标记的二抗，通过底物显 色反应检测抗体。
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自动化与智能化
随着技术的发展，ELISA技术将进一步实现自动 化和智能化，提高检测效率和准确性。
多指标并行检测
未来ELISA技术将朝着多指标并行检测的方向发 展，能够同时检测多种指标，提高检测效率。
3
纳米技术与ELISA的结合
纳米技术将为ELISA技术带来新的突破，如纳米 探针、纳米酶等，提高检测灵敏度和特异性。
ELISA技术在食品安全检测中的应用实例
农药残留检测
ELISA技术可用于检测食品 中的农药残留，确保食品 的安全性。
兽药残留检测
ELISA技术可用于检测肉类、 禽蛋等食品中的兽药残留， 保障消费者的健康。
生物毒素检测
ELISA技术可用于检测食品 中的生物毒素，如细菌毒 素、真菌毒素等。
ELISA技术的发展前景和展望
选择适当的读数仪器和方法，确保实验结果的准确性和可靠性。
操作步骤
按照实验要求，进行加样、孵育、洗涤、显色等操作，确保实验过程的规范性和 准确性。
03
ELISA技术的质量控制
实验前的准备和要求
试剂准备
确保所有试剂都符合质 量标准，没有过期，且
在有效期内使用。
设备校准
确保所有的实验设备， 如酶标仪、洗板机等， 都经过校准，以确保结

洗涤
洗涤在ELISA过 程中虽不是一个 反应步骤，但却 也决定着实验的 成败。
聚苯乙烯等塑料对蛋白 质的吸附是普遍性的而 在洗涤时可清除在反应 过程中非特异性地吸附 于固相载体的干扰物质
洗涤时可清除残留在 板孔中没能与固相抗 原或抗体结合的物质
洗涤方式（浸泡式）
a.
甩干孔内反应液；
b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，
即甩去）；
c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置3分钟，间
歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；
d. 甩去液体后在吸水纸上拍干；
e.重复操作c和d，洗涤3次。
保 温
1）在ELISA中抗原抗体反应的完成需要 有一定的温度和时间，这一保温过程称
为温育。
2）温育常采用的温度有43℃、37℃、室 温和4℃（冰箱温度）等。 3）保温时为避免蒸发，板上应加盖，也 可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。
• 抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面， 并且保持其免疫活性； • 抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结 合物，同时保持各自的免疫活性和酶活 性； • 酶结合物与相应的抗原或抗体结合后， 能通过加入底物的颜色反应来确定免疫 反应的发生，颜色反应的深浅与标本中 相应抗原或抗体的量成正比。
ELISA 的分类、原理和操作
显色和比色
显色是ELISA中的最后一步温育反应，此 时酶催化无色的底物生成有色的产物。 在定量测定中，加入底物后的反应温度 和时间应按规定力求准确。定性测定的显 色时间一般不需要严格控制及时判断。 比色使用酶标比色仪在405nm波长读数。 若要终止反应，以防反应过度，常用的碱 性磷酸酶反应终止液为1M NaOH,每孔 100ul。

竞争法 原理：通过a组和b组显色的差异，来确定标 本中待测蛋白的量

将特异性抗体与固相载体结合 加入待测抗原与抗体结合
洗涤去除未结合的抗原
双抗体夹心法ELISA原理示意图
01
加入酶标记的二抗与另 一特异性抗体结合，形 成双抗体夹心结构
02
洗涤去除未结合的酶标 二抗
03
加入底物，酶催化底物 生成有色产物
04
通过比色或分光光度法 测定吸光度，计算抗原 含量
04 ELISA实验数据 分析与解读
发展历程
自1971年Engvall和Perlmann首次 报道以来，ELISA技术得到了迅速 发展和广泛应用。
免疫学基础与抗原抗体反应
免疫学基础
免疫系统能够识别和清除外来抗原，维持机体内环境稳定。
抗原抗体反应
抗原与抗体特异性结合形成免疫复合物，引发一系列免疫反应。
ELISA技术分类及应用领域
技术分类
靠性。
数据分析策略及软件工具介绍
描述性统计分析
方差分析（ANOVA）
对数据进行初步的描述性统计分析，如计算 平均值、标准差、变异系数等，以了解数据 的分布和离散程度。
用于比较不同组别之间的差异显著性，如比 较不同浓度标准品或不同处理组之间的吸光 度值差异。
回归分析
软件工具
通过建立数学模型，探究自变量（如标准品 浓度）和因变量（如吸光度值）之间的线性 或非线性关系。
ELISA原理示意图详解ppt 课件
目录
• ELISA基本原理与概述 • ELISA实验步骤与操作规范 • ELISA原理示意图详解 • ELISA实验数据分析与解读 • ELISA技术应用案例分享 • ELISA技术挑战与发展趋势
01 ELISA基本原理 与概述
ELISA定义及发展历程
定义

2 核对仪器
确保酶标仪正常运行， 并进行校准和调试。
3 设定样品量
根据实验要求和预期结 果，设定合适的样品量。
ELISA操作流程
取样品
使用移液管准确地取出待测样品，并转移至反 应孔板中。
混合试剂
根据实验要求，将不同试剂混合，并加入反应 孔板中。
洗涤反应孔板
使用洗涤缓冲液彻底洗涤反应孔板，去除非特 异性结合物。
3
反应孔板处理
处理反应孔板，包括洗涤、封闭非特异性结合位点等步骤。
4
标准曲线绘制
通过稀释标准品制备标准曲线，用于分析待测样品的浓度。
材料清单
反应孔板
96孔黑胶板
用于测定光学密度
洗涤缓冲液
用于洗涤反应孔板
实验前准备工作
1 检查试剂
确认试剂溶液的保存状 态和有效期限，避免使 用过期或变质的试剂。
添加底物溶液
加入致色底物溶液，观察反应孔板颜色的变化。
实验注意事项
避光操作
在取样、反应和测量过程中， 避免试剂暴露在强光下，以 保证测量结果的准确性。
注意交叉污染
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，避免不同试剂之间的交 叉污染。
标准曲线绘制
密切按照标准曲线绘制的要 求进行操作，以获得准确的 样品浓度。
结果分析
如何避免交叉污染？
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，并避免将试剂污染到外 部容器或工作台。
应该如何解读ELISA 实验结果？
根据标准曲线将光学密度值 转化为样品浓度，并根据浓 度结果判断样品中目标物质 的含量。
1 测量光学密度
使用酶标仪测量各反应孔板的光学密度，并记录数据。
2 标准品对照
根据标准曲线将测得的光学密度值转化为待测样品的浓度。

结果：酶催化 底物发生显色 反应，颜色深 浅与抗原抗体 复合物的量成
正比
结果判定
阳性结果：出现两条色带，一 条在检测线，一条在质控线
阴性结果：只出现一条色带， 在质控线
无效结果：无色带出现，或出 现多条色带
结果解释：根据色带的出现情 况，判断样本中是否存在待测 物质
03
ELISA实验步骤
样品采集与处理
检测细菌抗体
实验原理：利用抗 原抗体特异性结合 的原理，检测样品 中是否存在特定细 菌抗体
实验步骤：样品处 理、抗原抗体孵育、 洗涤、显色、结果 分析
应用领域：医学、 生物学、食品科学 等领域
注意事项：避免交 叉污染，确保实验 结果的准确性
检测寄生虫抗体
抗体检测：通过ELISA实验 检测寄生虫抗体
样品处理：对样本进行预处 理，如离心、过滤、稀释等
样品采集：选择合适的样本， 如血液、尿液、组织等
样品保存：将处理后的样本 保存在适当的条件下，如低
温、避光等
样品检测：使用ELISA试剂 盒进行检测，按照说明书进
行操作
加样
加样步骤：将待测样品和标准品分别加入相应的孔中 加样量：根据实验要求，一般每个孔加入100μL 加样顺序：先加标准品，再加待测样品 加样注意事项：避免气泡产生，避免交叉污染
寄生虫种类：包括但不限于 蛔虫、钩虫、鞭虫等
实验步骤：样本处理、抗体 孵育、洗涤、显色、结果分
析等
结果解读：根据实验结果判 断是否感染寄生虫，以及寄
生虫种类和数量
检测肿瘤标志物
ELISA实验原理： 利用抗原抗体特 异性结合的原理， 检测肿瘤标志物
肿瘤标志物种类： 包括CEA、 CA125、CA199 等

洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验 的成败。
ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物 质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种
非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1.定义 2.分类
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。
➢ 间接法（Indirect ELISA）：
• 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 • 检测液相中未知抗体
➢ 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：
Please Criticize And Guide The Shortcomings
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
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感
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体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体） 起反应。
④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），最 后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。
⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。 ⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据
颜色反应的深浅来定性或定量分析。
免疫标记
显色
HRP的底物
DH2+ H2O2 E D+ 2H2O
上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。

成本较高
高质量的抗体和酶标仪等设备 的成本较高，限制了其在一些
领域的应用。
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技术挑战与发展趋势
提高自动化程度
开发自动化ELISA检测系统，减 少人为操作误差，提高检测效 率。
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发展多重检测技术
在同一反应体系中同时检测多 种目标分子，提高检测通量。
提高特异性
通过改进抗体设计和筛选方法 ，提高抗体的特异性，减少交 叉反应。
优点
适用于检测大分子抗原，如病毒 、细菌等。
缺点
需要针对每种抗原制备特异性抗 体，成本较高。
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竞争法
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原理
将特异性抗体与固相抗原竞争结合待检抗原，形 成抗体-抗原复合物，再加入酶标二抗与复合物 结合，最后加入底物显色。
优点
适用于检测小分子抗原或半抗原，如激素、药物 等。
3
缺点
抗原与抗体的特异性结合
免疫记忆
抗原表位与抗体超变区互补，形成稳 定的抗原-抗体复合物。
免疫系统对再次遇到的相同抗原产生 更快、更强的应答。
免疫应答
机体对抗原的识别、应答和清除过程 ，包括细胞免疫和体液免疫。
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ELISA技术原理
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酶标记抗体/抗原
利用酶的催化作用放大抗 原-抗体结合的信号，提高 检测灵敏度。
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优点分析
高灵敏度
ELISA技术能够检测到非 常低浓度的目标分子，
适用于痕量分析。
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特异性
通过使用特定的抗体-抗 原反应，可以实现高特 异性的检测，减少假阳