组织病理切片以及HE染色说课讲解

组织病理切片以及HE染色（一）实验原理：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述正常和病变组织的形态学，而且HE切片可较长时间保存，被称为常规染色方法。

（二）实验步骤：一、制作切片1、取材、固定：取小鼠肾脏组织适当大小，并且放入盛有固定液的小瓶中保存。

2、组织的脱水、透明、浸蜡与包埋组织固定后还需经过脱水、透明、浸蜡等过程才能制成蜡块，进行石蜡切片。

脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。

组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，使石蜡浸入组织块。

在此过程中，因组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变得透亮，因此称之为透明。

组织染色后也要进行透明。

最常用的透明剂为二甲苯，处理时间为30min左右。

组织经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。

用其他浸透剂（如火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入。

为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过3小时的浸渍，期间需更换3次石蜡。

一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56℃。

组织块经过浸蜡或浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋，包埋后便制成含组织的块。

这种包埋块可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。

石蜡包埋是病理日常工作中最常用的包埋方法。

用于包埋的石蜡熔点一般为60℃左右。

但在有些情况下，如某些酶染色时，则需采用低温石蜡包埋，以保存组织内酶的活性。

3、切片、制片石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片机，以前者为多用。

切片厚度一般为3-5μm。

切片时先将组织片平摊于一块玻璃上，迅速滴加30％的酒精水溶液使组织片完全展开，再移入40℃恒温热水器中。

也可直接将组织切片移入40℃的恒温热水器中，待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经56-60℃烤片30-60min后即可进行染色。

二、HE染色1. 二甲苯脱蜡2×10 min；2. 无水乙醇洗去二甲苯2×5min；3. 95％、80％乙醇各l0 min，自来水洗l min（不要让急水直接冲至载玻片上的组织），蒸馏水洗1min；4. 苏木素染色4 min，自来水洗2 min；5. 1％盐酸酒精分化20 s（镜下控制），自来水洗2 min；6. 1％稀氨水返蓝30s（镜下控制），自来水洗2分钟，蒸馏水洗1min；7. 伊红染色90s；8. 80％乙醇脱水10s，95％酒精10s，无水乙醇5min；9. 无水乙醇10min；10.二甲苯2×10 min；11.中性树胶或加拿大树胶封片。

5～10分钟 5～10分钟 3～5分钟 3～5分钟 3～5分钟 3～5分钟 1～2分钟 1～2分钟 5～8分钟 2～3秒
石蜡切片的HE染色
11.1%的盐酸乙醇 12.流水冲洗 13.0.5%的伊红水溶液 14.蒸馏水稍洗 15.80%的乙醇 16.95%的乙醇 17.无水乙醇(Ⅰ) 18.无水乙醇(Ⅱ) 19.无水乙醇(Ⅲ) 20.二甲苯(Ⅰ) 21.二甲苯(Ⅱ) 22.中性树胶封片
石蜡切片的HE染色
苏木精
一种天然染料，本身不能染色，氧化后变成苏 木红才成为真正的染料，苏木对细胞核的亲和 力需媒染剂的帮助，此时细胞核呈红色，只有 在碱性环境中，苏木才变成蓝色。
伊红Y
人工合成染料，它可能是通过渗透或弥散作用完 成染色的，故与组织结合不牢固，它对细胞质着 色。
染色原理
石蜡切片的HE染色
2.二甲苯脱蜡后按常规 是用无水乙醇洗去二甲 苯。
4.1%盐酸乙醇分 化液分化时间要 根据分化液的新 旧适当调整。
3.苏木精染液要配好，其好 坏决定染色的优劣。要定期 过滤，避免氧化膜及沉淀等 污染切片。
石蜡切片的HE染色
5.盐酸-乙醇分化后用流水冲洗时间要足够， 目的是把酸彻底冲洗干净，使组织返蓝，也 避免切片残留酸液使切片易褪色。
因此，把第16步的无水乙醇改 为苯酚二甲苯(1:3)混合液进行 脱水，可省去第17步的无水乙 醇，脱水时间3～5分钟，可彻 底脱去切片水分
石蜡切片的HE染色
8.苯酚别名石炭酸，为白色针状结晶，配制苯酚 二甲苯前需要将苯酚放入56℃温箱内或水浴加热 溶解。苯酚如被氧化变成红色，不能使用。
9.使用一些二甲苯代替品如松节油代替二甲苯脱 蜡和透明，可避免二甲苯的毒性，但脱蜡和透明 效果会比二甲苯差，需要增加脱蜡和透明时间。

此种方法无需“分化”，例如，卡红染色。
退行性染色：是先把组织浓染过度，超过所需的 程度，然后再用某些溶液脱去多余的染色剂，以 达到适当的深度，并使不应着色的组织细胞脱色。
这个步骤称为“分化”。
组织切片染色技术
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三、染色原理
直接染色，间接染色和媒染剂
直接染色：染色无需第三种物质参加，染色剂和组织 即可直接结合着色。
3．各种染料试剂一般选用化学纯。各种染料启用新品时 应先试染。配成的染液、试液应盛于有色试剂瓶内，瓶签 应写明名称、含量、配制年月日，顺序保存于避光橱中， 必要者放冰箱内。凡须临用时配制者，配量应适当。
4．染色各步骤所需的时间，常受温度、切片厚度等影响，
可根据镜下观察所见酌情予以调整。
组织切片染色技术
有橘黄G、刚果红、俾士麦棕和许多苏丹类的脂质染色剂。
（4）醌亚胺类：含有两个发色团，一个是印胺基（-N=）、一个 是醌型苯环，如硫堇、美蓝、甲苯胺蓝O、硫酸尼罗蓝、中性红和 碱性藏红花O、焦油紫等。
（5）苯甲烷染料：发色团是醌型苯环，如孔雀缘、浅绿、碱性品 红、酸性品红、结晶紫和甲基缘等。
（6）山叮染料：发色团是醌型苯环，如派罗宁和伊红Y等。
(2)吸收作用：又称溶解学说。
组织吸收染色剂，牢固的结合。 组织的着色与溶液的颜色相同。
组织切片染色技术
6
三、染色原理
(3)吸附作用
是固体物质的特性，即较大的物体能从周围溶液(染 液)中吸附一些小颗粒(化合物或离子)到自身的特性。
细胞中各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因此能选
择性地吸收不同的离子，即某种蛋白质对某种染色剂
3．流水冲洗还原组。织切片染色技术
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二、苏木素-伊红染色液的配制

组织病理切片以及HE染色（一）实验原理：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述正常和病变组织的形态学，而且HE切片可较长时间保存，被称为常规染色方法。

（二）实验步骤：一、制作切片1、取材、固定：取小鼠肾脏组织适当大小，并且放入盛有固定液的小瓶中保存。

2、组织的脱水、透明、浸蜡与包埋组织固定后还需经过脱水、透明、浸蜡等过程才能制成蜡块，进行石蜡切片。

脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。

组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，使石蜡浸入组织块。

在此过程中，因组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变得透亮，因此称之为透明。

组织染色后也要进行透明。

最常用的透明剂为二甲苯，处理时间为30min左右。

组织经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。

用其他浸透剂（如火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入。

为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过3小时的浸渍，期间需更换3次石蜡。

一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56℃。

组织块经过浸蜡或浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋，包埋后便制成含组织的块。

这种包埋块可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。

石蜡包埋是病理日常工作中最常用的包埋方法。

用于包埋的石蜡熔点一般为60℃左右。

但在有些情况下，如某些酶染色时，则需采用低温石蜡包埋，以保存组织内酶的活性。

3、切片、制片石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片机，以前者为多用。

切片厚度一般为3-5μm。

切片时先将组织片平摊于一块玻璃上，迅速滴加30％的酒精水溶液使组织片完全展开，再移入40℃恒温热水器中。

也可直接将组织切片移入40℃的恒温热水器中，待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经56-60℃烤片30-60min后即可进行染色。

二、HE染色1. 二甲苯脱蜡2×10 min；2. 无水乙醇洗去二甲苯2×5min；3. 95％、80％乙醇各l0 min，自来水洗l min（不要让急水直接冲至载玻片上的组织），蒸馏水洗1min；4. 苏木素染色4 min，自来水洗2 min；5. 1％盐酸酒精分化20 s（镜下控制），自来水洗2 min；6. 1％稀氨水返蓝30s（镜下控制），自来水洗2分钟，蒸馏水洗1min；7. 伊红染色90s；8. 80％乙醇脱水10s，95％酒精10s，无水乙醇5min；9. 无水乙醇10min；10.二甲苯2×10 min；11.中性树胶或加拿大树胶封片。

皮肤组织形态学he染色亲爱的读者朋友们，今天，我们将带大家走进皮肤组织形态学的大门，深入了解一种常用的染色技术——He染色。

请跟随我们的脚步，一起探索皮肤微观世界的奥秘吧！一、引言皮肤是人体最大的器官，它不仅保护我们免受外界环境的侵害，还与众多生命活动息息相关。

皮肤组织形态学是一门研究皮肤组织结构、形态和功能的学科。

而He染色，作为一种常用的皮肤组织染色技术，能够清晰地展示皮肤组织的细微结构，为病理学、组织学和遗传学研究提供了重要的实验手段。

二、He染色的原理与步骤1. 原理：He染色是一种基于氢醌单缩盐酸盐染料的染色方法，通过特定的染色步骤，可以使得皮肤组织中的某些细胞器和细胞成分显色，从而清晰地显示出皮肤组织的形态结构。

2. 操作步骤：(1)取适量皮肤组织块，用甲醛溶液固定。

(2)将固定好的组织块经过一系列的脱水和透明处理。

(3)将组织块浸入He染液中，进行染色反应。

(4)染色完成后，进行镜下观察和拍照。

三、染色效果解析He染色能够清晰地显示出皮肤组织的各种细胞器和细胞成分，如细胞核、细胞质、线粒体、内质网等。

通过这种染色方法，我们可以观察到皮肤组织的微观结构，了解皮肤细胞的种类、分布和功能。

此外，He染色还可以用于病理学研究中，对皮肤病变进行形态学诊断。

四、应用与展望He染色技术在皮肤组织形态学研究中具有广泛的应用。

首先，它为皮肤科医生提供了诊断皮肤疾病的依据，如色素痣、银屑病等。

其次，在遗传学研究中，He染色可以帮助研究人员了解基因表达和调控机制，为基因治疗提供理论基础。

此外，He染色还可用于组织工程和药物筛选等领域。

未来，随着科学技术的发展，He染色技术将不断改进和完善，为皮肤组织形态学研究提供更多便利和可能。

我们相信，在未来的研究中，He染色将会发挥更大的作用，为人类健康和医学进步做出更多贡献。

总结：He染色作为一种常用的皮肤组织染色技术，通过其独特的原理和操作步骤，能够清晰地展示皮肤组织的微观结构。

组织切片制作及he染色流程Title: Organ Section Preparation and HE Staining ProcessTask: To create a document that details the process of organ section preparation and hematoxylin and eosin (HE) staining, with alternating English and Chinese paragraphs.Paragraph 1:The initial step in the organ section preparation process is to fix the tissue.This is done by immersing the tissue in a fixative solution, such as formalin, for a specific period of time.After fixation, the tissue is dehydrated by replacing the fixative with a series of increasing concentrations of alcohol.Dehydration is followed by clearing, where the tissue is immersed in a clearing agent, such as xylene or a xylene substitute.The final step before embedding is infiltration, where the tissue is immersed in a molten embedding medium, such as paraffin wax, until it is fully saturated.切片制作的第一步是固定组织。

• 返蓝作用 苏木素在酸性环境下成红色，在碱性环境下成蓝色。因 此分化后，细胞核成红色，用弱碱性水，可是细胞核成蓝色，增强 对比。
• 细胞浆染色 伊红为酸性染料，带负电荷，与胞浆中的带正电荷的蛋 白结合，使胞浆成红色。
实验流程：
1.取材
2. 固定、脱水、透明
3. 浸蜡
4. 包埋
5. 切片
6. 展片
石蜡切片法广泛应用于医学、农学、动植物学等学科。是教学、 科研中的常用实验技术。
实验原理：
苏木素(Hematoxylin)和伊红(Eosin)联合染色，简称HE染色， 是病理学常规制片中最基本的染色方法，应用极其广泛。苏木精是从 洋苏木中提取出来的浅黄褐色的结晶，是一种碱性染色剂，它在被氧 化后生成苏木素，同媒染剂(常用的是三价的铝或盐铁)一起使用，能 够使细胞核染色。在H.E.染色的组织切片中，细胞核呈蓝色，细胞浆 呈红色，二者形成鲜明的对比，易于观察分析。
动物组织的石蜡切片制作 及H.E.染色
实验目的：
1. 掌握动物材料的石蜡切片制作方法。 2. 学习H.E.染色方法。
实验原理：
石蜡切片法，是以石蜡作为包埋剂的一种显微制片方法，是形 态学观察最基本、最经典的技术之一。
一般来说，凡是可以经受石蜡法中各试剂处理的材料都可以用石 蜡法制片。石蜡切片一般要经过取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包 埋、切片、展片、粘片、复水、染色、封藏等过程。
鼠肝组织-脱蜡前 40×
鼠肝组织-脱蜡后 40×
鼠肝组织-苏木素染色 400×
鼠肝组织-伊红B染色 1000×
实验结果
学生实验结果
注意事项：
• 使用试剂时注意戴好口罩、手套，必要时使用通风橱。 • 包埋过程尽量连贯、快速。 • 操作切片机时，务必注意安全，防止刀片伤手。 • 展片过程中确保组织蜡片始终正面朝上。 • 粘附载玻片只在正面涂有粘片剂，样品要粘在正面。 • 吸水后观察样品应紧贴在玻片上，方可避免在后续的处理中样品丢

3. 尸体解剖组织（脏器）取材：略。
第16页，共118页。
三．固定（ fixalion）
固定：新鲜组织浸泡在适宜的化学试 剂内借助于化学试剂的作用，使组织或细 胞内蛋白质凝聚，沉淀，成为溶性并保持 组织细胞原有的形态结构：称为固定。所 使用的化学试剂配成的溶液，称为固定液。
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浓甲醛 75ml 冰醋酸 5ml (对组织收缩小，固定均匀、保存细微结构、软化皮肤、 肌健、结缔组织较好 )
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3、固定的原理
甲醛为例，甲醛与组织蛋白反应是多样而复杂的。
O
H
P CONH+HCH+P-CONH P -CON---C----P--CON 肽键 甲醛 H 亚甲基桥
蛋白质分子之进行交换，形成亚甲基桥，把蛋白质分子串 联起来，使蛋白变性，破坏了蛋白质的立体结构，达到固 定目的。
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四、洗涤
组织在固定后，一定要把渗透到 里面的固定液(沉淀物或结晶)洗去， 然后再进行下一步程序，洗涤必须彻 底，否则留在组织中的固定液有可能 妨碍染色。
第28页，共118页。
洗涤的原则：
1、固定液为乙醇或酒精混合液一般不要 冲洗。
2、固定液为水配制者，用水流水冲洗 3、凡含有铬酸、重铬酸钾的固定液-洗涤 4、含有苦味酸用乙醇配制的固定液-洗涤
2. 方法：
第45页，共118页。
3. (1) 最大平面向下压平 (2) 管状 束壁 皮肤 竖埋
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七、浸蜡（Infilftrition）
组织经过媒剂的透明作用后，移 入熔化的石蜡内浸渍称为浸蜡。
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１、 石蜡：
切片蜡___软蜡50℃以下，酶，保存抗原活性 (纯度高密度好) 硬蜡50℃以上-62∽64℃ 工业石蜡___质地较差，价格便宜

HE染色，全称为苏木精-伊红染色（Hematoxylin and Eosin Staining），是生物学和医学领域中常用的一种细胞和组织染色方法。

它主要用于观察细胞核的形态结构、染色体的分布以及细胞质的成分。

HE染色方法简单、结果清晰，因此在病理学、细胞学和遗传学等领域得到了广泛的应用。

HE染色的原理是通过化学反应使细胞和组织中的特定成分着色，从而呈现出不同的颜色。

在HE染色过程中，首先使用苏木精（Hematoxylin）对细胞核进行染色，使其呈现出深蓝色或紫蓝色；然后使用伊红（Eosin）对细胞质进行染色，使其呈现出粉红色或红色。

通过对比两种颜色的分布，可以清晰地观察到细胞核和细胞质的结构。

HE染色的主要步骤如下：1. 切片制备：将组织切成薄片，通常厚度为4-10微米。

切片的质量直接影响到染色结果的准确性和清晰度。

2. 固定：将切片放入固定液中，使细胞内的蛋白质凝固，防止后续染色过程中细胞结构的破坏。

3. 脱水：将固定后的切片依次放入不同浓度的酒精溶液中，使水分逐渐减少，有利于染料的渗透。

4. 渗透：将切片放入含有苏木精的染液中，使染料渗透到细胞内。

此时，细胞核内的DNA 与苏木精结合，呈现出深蓝色或紫蓝色。

5. 清洗：将切片从染液中取出，用清水冲洗，去除多余的染料。

6. 分化：将切片放入含有酸性溶液的染液中，使细胞核内的苏木精与酸性溶液反应，呈现出不同的深浅程度。

这一步骤有助于区分细胞核的不同区域。

7. 清洗：将切片从染液中取出，用清水冲洗，去除多余的酸性溶液。

8. 脱水：将切片依次放入不同浓度的酒精溶液中，使水分逐渐减少，有利于染料的渗透。

9. 渗透：将切片放入含有伊红的染液中，使染料渗透到细胞质中。

此时，细胞质内的蛋白质与伊红结合，呈现出粉红色或红色。

10. 清洗：将切片从染液中取出，用清水冲洗，去除多余的染料。

11. 透明：将切片放入透明剂中，使切片透明化，便于观察。

12. 封片：将透明后的切片放在载玻片上，用封片胶封住，避免水分蒸发和污染。

大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE 染色步骤如下：（一）固定与修块取组织块放入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。

6小时左右后用双面刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。

（二）脱水与透明1．75%乙醇50分钟2．85%乙醇50分钟3．95%乙醇（I）30分钟4．95%乙醇（II）30分钟5．100%乙醇（I）30分钟6．100%乙醇（II）30分钟7 1/2 二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20分钟8．二甲苯（I）20分钟9．二甲苯（II）10分钟（可依据透明效果而定）若脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。

在每一步骤之后，要充分滤干组织块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但也要防止组织块干燥。

全过程约需要5h。

（三）浸蜡、包埋与修蜡块1．浸蜡：将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，将组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温箱120分钟。

2．包埋：将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下。

不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。

为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。

3．修蜡块：待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。

（四）切片在载玻片上擦少量甘油蛋白。

可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹匀，呈半干状为佳。

切片厚约4-8μm，将切片在55℃左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。

用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，放入37℃烘箱中过夜。

每个组织块捞片2张。

过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。

（五）脱蜡、染色与脱水倾斜玻片架，将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干，减轻对其他试剂浓度的影响。

全过程约需要60分钟。

1．脱蜡（1）二甲苯（I）15分钟（2）二甲苯（II）15分钟（3）100%乙醇2分钟（4）95%乙醇（I）1分钟（5）95%乙醇（II）1分钟（6）蒸馏水浸洗1分钟2．染色（7）苏木精30秒钟（8）自来水冲洗60秒。

1 组织切片1、剪取组织,10 %甲醛固定。

2、已经固定好的组织依次在70 %、80 %、90 %、95 %、95 %、100 %的乙醇溶液中浸泡15-20 min，3、再浸入乙醇和二甲苯（1:1）的混合溶液中15-20 min，然后浸入二甲苯直到透明，将透明的组织浸入石蜡和二甲苯（1:1）的混合溶液中浸泡1 h，用石蜡进行固定。

4、包埋、切片2组织切片HE染色染色结果：细胞核呈蓝色，细胞的细胞质呈粉红色。

步骤：1、组织切片用二甲苯脱蜡15 min，再次用二甲苯进行脱蜡15 min，2、浸入二甲苯和酒精混合溶液（1:1）3 min，依次浸入100%、95 %、90%、80%、70%、50%乙醇各2 min。

3、苏木素染色5 min, 自来水冲洗3 min, 1 %盐酸2 s，自来水冲洗2 min, 依次浸入50 %、70 %、80 %乙醇2 min,伊红浸泡5 s。

4、 95 %、100 %、100 %乙醇各2 min，最后连续2次二甲苯各15 min，封片。

3 组织切片免疫组化检测1、组织切片置于58 ℃烘箱内烤片20 min, 然后取出待冷却后，进行脱蜡。

2、连续2次二甲苯脱蜡各15 min，依次浸入100 %、95 %、80 %乙醇、蒸馏水各2 min。

3、高压抗原修：将3 L柠檬酸盐缓冲液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。

切片置于切片架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖高压锅压阀。

当压力锅开始慢慢喷气时（加热5-6 min）计时1-2 min，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，蒸馏水冲洗，PBS洗，片子室温冷却20 min，再次PBS洗。

4、免疫组化具体方法参照SP试剂盒（福州迈新）：1、室温，正常非免疫动物血清封闭30 min；2、一抗4 ℃ 12 h；3、用PBS清洗两次，每次2 min；4、室温，内源性过氧化物酶阻断1 h；用PBS清洗三次，每次2 min；5、室温，生物素标记的二抗30 min；用PBS清洗三次，每次2 min；6、室温，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶30 min，7、DAB显色5 min，蒸馏水冲洗；8、Gill’s苏木素复染3 min；9、自来水流水冲洗5 min；依次95 %、100 %的乙醇脱水3 min；10、最后用二甲苯透明，封片，镜检，拍照。

5使 不 同 组 织 成 分 对 染 料 有 不 同 的 亲 和 力 ， 经 过 染 色 处 理 后易 于 辨 认 。
6. 防 止 细 胞 过 度 收 缩 或 膨 胀 而 失 去 其 原 有 形 态 结 构 。 7. 使 组 织 块 硬 化 ， 便 于 制 作 薄 片 。
第9页，共24页。
注 意 事 项 及 影响 固 定 的 因 素
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浸蜡
透蜡 是指将材料中的透明剂逐步清除， 以至完全由石蜡充分渗透。
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浸蜡
石蜡熔点选择54~580C，浸蜡温度较熔点高2~30C。 较硬的致密组织，例如骨、软骨、肌腱、皮肤、
子宫肌选用熔点较高的石蜡。
疏松及脆嫩组织，例如脑、脊髓、小动物肝脾选用 熔点较低的石蜡。
石蜡I：10~20分钟。 石蜡II：20~30分钟。 石蜡III：30~40分钟。
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包埋
是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡 一起倒入一定形状的容器内，并立即投 入冷水中，使它凝固成含材料的蜡块， 以备切片。
第21页，共24页。
包埋
新蜡反复熔化、冷凝，改善密度，提高韧性，质地均匀。
2注 射 、 灌 注 固 定 法. 某 些 组 织 块 由 于 体 积 过 大 或 固 定 掖 极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定。
如 肺 可 将 固 定 液 从 气 管 或 支 气 管 注 入 .全 身 灌 注 固 定 较 大 动 物如 兔 、 猫 、 狗 、 猴 及 整 个 人 体 ,固 定 液 输 入 后 ， 可 不 必 即 刻 取 材 。小 动 物 ， 如 大 、 小 鼠 ，也可灌流固定.
以 使 固 定液 能 迅 速 而 均 匀 地 渗 入 组 织 块 内 部

组织病理切片以及HE染色（一）实验原理：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述正常和病变组织的形态学，而且HE切片可较长时间保存，被称为常规染色方法。

（二）实验步骤：一、制作切片1、取材、固定：取小鼠肾脏组织适当大小，并且放入盛有固定液的小瓶中保存。

2、组织的脱水、透明、浸蜡与包埋组织固定后还需经过脱水、透明、浸蜡等过程才能制成蜡块，进行石蜡切片。

脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。

组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，使石蜡浸入组织块。

在此过程中，因组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变得透亮，因此称之为透明。

组织染色后也要进行透明。

最常用的透明剂为二甲苯，处理时间为30min左右。

组织经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。

用其他浸透剂（如火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入。

为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过3小时的浸渍，期间需更换3次石蜡。

一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56℃。

组织块经过浸蜡或浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋，包埋后便制成含组织的块。

这种包埋块可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。

石蜡包埋是病理日常工作中最常用的包埋方法。

用于包埋的石蜡熔点一般为60℃左右。

但在有些情况下，如某些酶染色时，则需采用低温石蜡包埋，以保存组织内酶的活性。

3、切片、制片石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片机，以前者为多用。

切片厚度一般为3-5μm。

切片时先将组织片平摊于一块玻璃上，迅速滴加30％的酒精水溶液使组织片完全展开，再移入40℃恒温热水器中。

也可直接将组织切片移入40℃的恒温热水器中，待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经56-60℃烤片30-60min后即可进行染色。

二、HE染色1. 二甲苯脱蜡2×10 min；2. 无水乙醇洗去二甲苯2×5min；3. 95％、80％乙醇各l0 min，自来水洗l min（不要让急水直接冲至载玻片上的组织），蒸馏水洗1min；4. 苏木素染色4 min，自来水洗2 min；5. 1％盐酸酒精分化20 s（镜下控制），自来水洗2 min；6. 1％稀氨水返蓝30s（镜下控制），自来水洗2分钟，蒸馏水洗1min；7. 伊红染色90s；8. 80％乙醇脱水10s，95％酒精10s，无水乙醇5min；9. 无水乙醇10min；10.二甲苯2×10 min；11.中性树胶或加拿大树胶封片。

注意事项： 5.多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，
于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既 不费时也不会乱。
6.放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，如果胡乱放置， 就不能收到很好的效果。
注意事项： 7.组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液。临床快速冰
5～10秒 2～5秒 1分钟 2～5秒 2～3秒 2～5秒
冷冻切片HE染色
操作流程： 7.促蓝液 8.流水冲洗 9.0.5%的伊红水溶液 10.水洗 11.80%的乙醇 12.பைடு நூலகம்5%的乙醇
2～5秒 5～10秒 2～5秒 1～2秒 1～2秒 1～2秒
冷冻切片HE染色
操作流程： 13.无水乙醇 14.苯酚二甲苯(1:3) 15.二甲苯(Ⅰ） 16.二甲苯(Ⅱ) 17.二甲苯(Ⅲ) 中性树胶封固
2～5秒 2～5秒 2～5秒 2～5秒 2～5秒
冷冻切片HE染色
染色结果：细胞核蓝色,细胞质和纤维红色。 注意事项： 1.乙醚-乙醇液是由乙醚和95%的乙醇各50ml，再加冰醋酸5滴混匀而
成,应密封保存。 2.冷冻切片HE染色操作要求时间短，因此，各种试剂要经常更换新液。
注意事项： 3.如果使用 Harris苏木精染液，应尽可能用新液；如果使用改
良 Lillie-Mayer苏木精染液则需存放1周后才用。
4.防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除 切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸 擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的 包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整 切出。。
当切片时如果发现冰冻过度时可将冰冻的组织连同支承器取出来在室温停留片刻再行切片或者用口中哈气或者用大拇指按压组织块以此来软化组织再行切片

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2、AAF液 配制 : 纯酒精85ml+醋酸 5ml+甲醛10ml
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5）尽可能避免使组织膨胀或收缩。 6）能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或 沉淀下来。 7）增加细胞内含物的折光程度，易于鉴 别。增加媒染作用和染色能力。 8）使组织变硬，适于制片，但又不使材 料太坚硬而松脆。 9）使组织充分固定，便于保存。
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第二节
介绍几种常见固定液
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第一章 病理技术的应用范围
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➢帮 助 临 床 查 明 死 因 （ 原 因 不 明 的 死 亡 ） ➢手 术 后 病 变 标 本 ， 以 明 确 诊 断 （ 临 床 活检） ➢提供教学、科研的资料
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第一节 组织制片的概述
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组织制片技术的应用，从1665 年由HOOk发现细胞开始，已有300 多年的历史。最早应用冰冻切片；随 后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡 包埋组织，制成石腊切片；后来又利 用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质 的韧性，以其包埋组织而制作切片。
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6、丙酮
丙酮又名醋酮或本酮，极易挥发、 易燃的无色液体，能与水、醇、氯仿、 醚及多种溶液混合。
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特性：
1）它可以作固定剂，又可作脱水剂，穿 透速度快，可使蛋白质沉淀凝固，2毫米 以下的组织固定半小时至1小时即可。 2）可引起组织较强的收缩使之变硬，对 核固定不佳。 3）对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、 酸性磷酸酶等。 4）丙酮一般多与氯化汞、甲醛混合液使 用，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定 以减少组织收缩和过度硬化。

肝硬化 ：肝细胞排列紊乱，形成假小叶，周围有的纤维分割
假小叶 纤维分割
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急性弥漫性毛细血管内增生性肾小球肾炎 ：毛
细血管球增大，细胞数目增多，肾小球囊腔狭窄
肾小管
毛细血管球
肾小球囊腔
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毒性甲状腺肿：滤泡上皮乳头状增生，可见吸收空泡，淋巴细胞浸
润 淋巴细胞
病理实验切片 附说明
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脾梗死
梗死区色淡红，细胞核 均消失，但该处脾组织 的轮廓还存在，梗死区 周围充血出血带不明显。
肝脂肪变：肝细胞浆内大量脂滴空泡,细胞核被推向一侧。
脂滴 空泡
第三页，共28页。
第四页，共28页。
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纤维瘤
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肺结核病：可见结核结节
肺泡
结核结节
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慢性肺气肿：肺泡间隔断裂，肺泡融合
融合的肺泡 肺泡间隔
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溃疡病 ：可见坏死组织、炎性渗出物合肉芽组织
炎性渗出物及坏 死组织
肉芽组织
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Байду номын сангаас
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急性蜂窝织性阑尾 炎
炎性病变呈扇面形由表浅层向深层扩延， 直达肌层及浆膜层。阑尾壁各层皆为大量 中性粒细胞弥漫浸润，并有炎性水肿及纤 维素渗出。阑尾浆膜面为渗出的纤维素和 中性粒细胞组成的薄膜所覆盖
纤维肉瘤
瘤细胞丰富，弥散 排列，与间质无明 显界限。
淋巴结转移性腺癌：淋巴组织内有腺癌组织
淋巴滤泡 腺癌组织
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鳞状细胞癌：癌细胞巢状排列，中间有角化珠，间质有淋巴细胞