发酵工程制药实验链霉菌发酵样本

《生物制药技术》实验指导-实验二《生物制药技术》实验指导实验二金霉素链霉菌的定向发酵（验证型）实验目的：1、学习和掌握无菌操作技术。

2、掌握定向发酵四环素的原理。

实验原理：定向发酵是指通过改变培养基组分(加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的产物。

金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：R1 R2金霉素Cl H土霉素H OH四环素H H金霉菌原是产生金霉素（Chlortetracycline）的菌种，但因金霉素比四环素只多一个氯离子，所以只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。

另外，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强；当温度超过35℃时则只合成四环素。

本实验中，利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制剂作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促进剂，分子式：C7H5NS2，通常作为橡胶硫化促进剂)抑制氯化酶的作用，从而增加四环素的产量。

材料、试剂和器材：金霉素链霉菌：购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（菌种保藏号：CGMCC4.1043；订单号20111133 550元）。

超净工作台、摇床（250ml、500ml）酒精灯、酒精棉球、工业酒精、打火机、接种铲、移液枪、剪刀实验步骤：前期准备工作：配制孢子培养基麸皮36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，琼脂15～20 g，定容至1L，pH 7。

1、制备斜面孢子：将保藏的菌种的比例接种于液体培养基中（不加琼脂的斜面培养基），28℃下200 r/min振荡培养，将活化1d后的金霉素链霉菌种接入孢子培养基，28℃培养5～7天，待孢子长成灰色，于4℃冰箱中保藏。

2、种子培养：在斜面上用接种铲挑取1cm2左右生长良好的菌体接入装有50ml四环素种子培养基的250ml锥形瓶中，230 r/min、28℃下振荡培养20～24h。

链霉菌实验操作1录入时间:2009/8/28 16:09:31 来源：食品科技网一、培养基、抗生素、生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, AmpChloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrerm Eaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?501051010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-5*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。

*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。

*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。

＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。

发酵工程制药实验：链霉菌发酵发酵工程制药实验是制药技术中的重要环节，通过对发酵过程的研究和实验，可以获得制造高质量药品的关键信息。

本文将介绍在实验室中进行链霉菌发酵的方法和步骤，并分析其中的关键因素。

实验目的链霉菌（Streptomyces）是一种广泛存在于自然界中、能够产生许多重要生物活性分子的细菌。

它们具有产生抗生素、抗肿瘤剂、免疫抑制剂等药物的能力，因此被广泛用于制药和医疗领域。

链霉菌的发酵实验可以帮助我们掌握其生长和代谢规律，了解影响链霉菌生长的因素如何调控，探索最优的发酵条件以提高目标产物的产量和纯度等。

因此，本实验的主要目的是：通过链霉菌发酵的实验，掌握发酵工程制药实验的基础理论和操作技巧，探索链霉菌发酵的优化条件。

实验步骤1. 配置培养基链霉菌生长需要适当的培养基，因此我们需要配置基于木质素和琼脂的培养基，其中需添加铁、镁等元素和麦芽糊精等营养成分。

将制备好的固体培养基加入烧过的三角瓶中，用自来水洗净后，用酒精灯加热瓶口和瓶颈，使其不受污染。

2. 实验前消毒和预先培养试管将消毒瓶（80%乙醇）放在洁净桌面上，将三角瓶紫外线灯消毒30分钟，然后将三角瓶横放在洁净桌面上，从洁净试管中取出玻璃珠，放入三角瓶内，用酒精灯烘干瓶口后盖上。

将预备菌株（常见的链霉菌菌株如海洋链霉菌、链霉菌菌株NRRL2234）在木质素琼脂平板上通过接种的方式进行预先培养。

3. 移液接种在曝气装置中注入适量空气使溶液震荡，将链霉菌菌液铸在劳氏肉汤培养基中，在摇床上进行培养。

培养过程中要定时观察并调节培养条件如温度、曝气速率和PH值等。

通过留取一定量的液体给种管，在适当的体积下移液接种，使样品达到合适的菌落密度。

4. 发酵条件的优化掌握适宜的链霉菌发酵条件对于产品的质量和产量至关重要。

在实验的不同时间点，进行样品的收获和检测，并结合实验室提供的分析工具和技能对链霉菌发酵进行分析和诊断，探寻出最适宜的发酵条件，从而可提高产品产量和质量，开发出更多的新药品。

链霉素发酵工艺验证方案1.目的：确认链霉素发酵系统工艺流程，确认种子工艺、小小罐工艺、小罐工艺、中罐工艺、大罐发酵工艺，验证该发酵系统工艺的稳定性和可靠性及制备的发酵液能否达到中间体规格要求。

2.范围：此方案包括一个50吨大罐链霉素发酵液的生产过程。

2.1验证地点：403车间发酵工段：2.2验证对象：2.2.1原斜面2.2.2代1、代2斜面2.2.3母瓶2.2.4子瓶2.2.5小小罐2.2.6小罐2.2.7中罐2.2.8大罐2.3验证步骤：确定验证方案，确定验证计划，内容、步骤，以便准确验证链霉素发酵系统。

3.验证措施概要：3.1生产记录：原斜面：冷藏期≤10天外观无菌外观集落:白色丰满、正常代1或代2斜面：冷藏期≤14天外观无菌外观集落：白色丰满、正常母瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价68小时≥1700u/ml效价96小时≥3500u/ml效价120小时≥6700u/ml冷藏期≤5天菌龄50~64小时菌丝II—III子瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价120小时≥7000u/ml效价144小时≥7500u/ml冷藏期≤7天菌龄30~44小时菌丝II—III小小罐：菌丝II—III镜检无菌放罐效价≥800u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5小罐：菌丝II—III镜检无菌放罐效价≥1200u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5中罐：菌丝II—III镜检无菌放罐效价≥1800u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5大罐：放罐残糖≤2.0克/100毫升放罐残氮≤120毫克/100毫升放罐透光度≥40%放罐效价≥14000u/ml3.2原材料：生产过程中所用的各种原材料及其规格（见原材料一览表）3.3设备：生产链霉素所及设备见设备一览表。

皖西学院生物与制药工程学院（制药设备与工程设计）课程设计班级姓名学号指导教师二○年月日皖西学院生物与制药工程学院制药设备与工程设计课程设计任务书课程设计说明书目录第一章设计资料（宋体，小三号）一、产品设计简介（宋体，四号）第3页二、设计参数和质量标准第4页第二章工艺设计与说明一、工艺流程图第5页二、工艺说明第5页第三章物料衡算与设备选型一、物料衡算第7页二、主要设备选型第9页第四章设计总结第11页附录：1.设备一览表第12页2.参考文献第13页第一章设计资料一．产品设计简介1. 筹建概况发酵厂厂区周围大气中的含尘量应在一定范围以下。

发酵工厂建在一级或二级区域中，周围没有散发大量有害气体的化工厂和产生大量灰尘的炼钢厂、炼焦厂、热电厂等。

并且与铁路及公路主要干线保持适当距离。

发酵工厂是耗能大户，并要求是二类负荷用电户。

该厂选址时注意到厂区用电能得到充分保证，并有充足水源。

六安用水主要来自于淠河，可将厂建于淠河中上游处，便于生产用水的供应。

我国规定在地震6度烈度或以下时在建设时不设防，六安属于此类地区，所以不考虑抗震设防。

2.产品方案与建设规模产品名称：链霉素生产规模：年产50吨产品主要物性：链霉素为白色或类白色粉末，无臭或微臭。

易溶于水，微溶于，不溶于、和。

抗菌范围比较广。

对革兰阴性细菌、结核杆菌和某些革兰阳性细菌都有抑制作用。

主要用于结核杆菌感染，也可用于布氏杆菌病、鼠疫等。

用于的，除外，还有、等。

本品能被植物植株吸收，对革兰氏阴性菌和阳性菌杀伤力强，预防效果明显，低温时持效期一般为7天左右，晴天3～4天。

本品适用于防治蔬菜软腐病，柑桔溃疡病，烟草野火病，黄瓜霜霉病、角斑病，辣椒炭疽病，番茄疮痂病，桃叶细菌性穿孔病，水稻拜叶枯病及其他植物细菌性病害。

使用方法：1、可喷雾（每袋加水50～100kg）、灌根或浸种；2、用于预防，每袋加水50kg（相当于200r），根据病害程度每亩用2～3袋；施药时间最好在上午10点前、下午3点后，喷药8小时内遇雨应补喷。

链霉素发酵实验分析及总结一、实验目的通过链霉素发酵获得链霉素，并测定相关参数；了解发酵的各个环节，综合运用本科阶段所学习的技能及知识。

二、实验材料及步骤略三、实验结果1、标准曲线的绘制管号1.002mg/ml葡萄糖浓度（ml）蒸馏水（ml）DNS（ml）葡萄糖浓度（mg/ml）OD值0 0.0 1.0 1.0 0.000 0.0001 0.1 0.9 1.0 0.100 0.0912 0.2 0.8 1.0 0.200 0.2103 0.3 0.7 1.0 0.301 0.3444 0.4 0.6 1.0 0.401 0.4395 0.5 0.5 1.0 0.501 0.5866 0.6 0.4 1.0 0.601 0.687所得的葡萄糖标准曲线回归方程为y=1.1985-0.0275，R2=0.9979.2、链霉素发酵密度、pH、氨态氮变化从表中我们可以知道：pH变化先降后生，变化曲线较为正常；密度的变化处于平稳状态；而氨态氮含量缓慢上升。

3、链霉素发酵还原糖、总糖、菌体湿重变化从图中可知：还原糖、总糖含量一直在减小，菌体湿重总体上升。

四、实验分析及感想本次发酵实验做的较为失败，没有发酵出链霉素，效价无法检测。

可能原因有以下几点：第一，实验过程中发生过空压机的“罢工”，具体多少时间也不知道导致罐内缺氧；第二，链霉菌虽然生长，但可能是因为缺乏表达活性，无法表达链霉素；第三，通过镜鉴前期菌体量在逐步增加，后4-8天菌体量基本不变，到最后菌体量有所衰减，这样的现象可能是环境导致。

实验虽然没有成功，但实验过程中我收获良多：我学会了用dns法，见习了发酵罐的用法和接种的火焰圈法。

还有发酵罐的使用注意事项，对分光光度计有了更深的认识和了解，我相信这对我以后会有很大的帮助。

还有和同学共同完成实验的经验。

实验2灰色链霉菌的活化一、实验目的学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。

二、实验原理高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。

三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌；2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。

四、实验步骤1. 高氏一号培养基的制备（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。

趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。

（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。

高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。

2. 斜面接种接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。

为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。

一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。

（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。

（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。

在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。

划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。

注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。

（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。

接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。

（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。

实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备一、实验目的学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。

实验名称：液体发酵法生产链霉素姓名：学号：系别：实验日期：同组同学名单：摘要】本实验包含了链霉素液体的发酵以及链霉素的检测、鉴定两个部分。

通过实验结果表明，链霉素发酵液的抑菌效果大于链霉素样品。

【实验目的】1.学习链霉素液体发酵方法2.学习链霉素的检测和鉴定方法【实验材料】菌种：E. coli，放线菌5406培养基：豌豆培养基、高氏1号培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基其他材料：水饱和正丁醇、层析缸、滤纸、毛细管、培养皿【实验方法及步骤】1、斜面孢子的制备用接种环挑取冰箱中保藏的菌种接种于豌豆培养基斜面培养基上，于27℃恒温培养基中培养6—7d,即可得到斜面孢子。

2、母瓶培养液的制备用接种环挑取斜面培养表面上的孢子接种于灭菌的含有50ml豌豆培养基的三角瓶中，于27℃摇瓶200r/min培养72h即成母瓶培养液。

3、种子培养基的制备无菌操作取2ml母瓶培养液接种于含有100ml豌豆培养基（或者高氏1号培养基）的三角瓶中，于27℃恒温摇床200r/min培养3—4d。

4、发酵培养取4ml种子培养液接种于含有200ml豌豆培养基（高氏1号培养基）的500ml 大三角瓶中，于28℃恒温摇床200r/min培养12—15d进行链霉素发酵。

5、发酵液预处理发酵结束后，将发酵液在低温条件下 12000r/min离心，上清即为含链霉素的样品。

6、发酵液抑菌实验0.2ml大肠杆菌菌液，待其表面干燥后，均匀贴上三个小滤纸片，分别在滤纸片上加等量（5μl）的发酵液、链霉素样品、水，于37℃恒温培养24h后观察结果。

7、链霉素的纸层析鉴定1)点样：在距滤纸底端1cm处一道横线，用毛细管将发酵液和标准链霉素溶液（10mg/ml）点在滤纸的横线上，每个样品之间距离1cm。

2)层析：将点好样的滤纸竖立在含有展层剂系统（水饱和的正丁醇）的层析缸中，室温下扩展10cm后取出，挥发除净溶剂。

3)显影（生物显影法）：首先将滤纸片在紫外下灭菌20min，铺一薄层牛肉膏蛋白胨固体平板，待凝固后，将灭菌的滤纸正面朝上铺在平板上，再倒一层牛肉膏蛋白胨固体，凝固后均匀涂布0.2ml大肠杆菌菌液，37℃培养20h,根据平板上样品抑菌区的位置判断抗生素的类型。