蛋白质——精选推荐

蛋白质

(四)蛋白质组学研究的生物信息学生物信息学是随着人类基因组计划、计

算机技术、网络技术的发展而诞生的一门新兴学科，是蛋白质组学的一个重要

的技术平台。生物信息学研究生物信息的采集、加工、分析、存储、传播等各个方面，它通过综合应用数学、计算机科学、工程科学以及生物学的技术来分

析大量而复杂的生物学数据而揭示生物学的奥秘。生物信息学是蛋白质组学研

究的一个不可缺少的部分，其在蛋白质组学中的研究有两个重要应用：一是构

建和分析双向凝胶电泳图谱，二是数据库的搜索与构建。蛋白质组数据库是蛋

白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组

数据库。目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST数据库。NRDB由SWISS-

PROT和GENPETP等几个数据库组成。dbEST是由美国国家生物技术信息中心

(National Centre for Biotechnology Information，NCBI)和欧洲生物信息学

研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)共同编辑的核酸数据库，包括许多生物体的表达序列标签(expressed sequence tags，EST)。用肽序列

标签(PST)或部分序列信息最适合查寻dbEST数据库。最近有报道强调用蛋白质

质谱分析数据查寻EST数据库以鉴定研究者最感兴趣的未知蛋白质的重要性，

表明人类EST数据库能满足用质谱数据快速识别哺乳动物多蛋白质复合物的要

求。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISS-PROT、

Rockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的

质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂

的拼接方式。随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数

据库。另外，对肽序列标记的从头测序软件也十分引人注目。(五)定量蛋白质组学研究随着蛋白质组学研究的深入发展，人们已不再满足对一个混合体系中

的蛋白质进行简单的定性分析，要求更加准确的定量分析。为此，有人提出了"

定量蛋白质组学"的概念。定量蛋白质组学，就是把一个基因组表达的全部蛋白

质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。这一概念的提出，

标志着蛋白质组学研究已从对蛋白质的简单定性向精确定量方向发展，并且成为当前蛋白质组研究的一个热点。蛋白质组研究和基因组研究相比最大的不同

和难点之一是定量，而蛋白质表达量的差异又是影响生物功能的重要因素。蛋

白质组定量技术现在还处于起步阶段，也面临很多难点：首先，对低丰度蛋白

质检测的困难显然阻碍对这些蛋白质的定量。其次，当蛋白质表达量差异很小，如在50%以下时，精确定量成为瓶颈。另外，生物体系中蛋白质表达瞬时变化

的捕捉是样品制备中需要关注的问题，总之，蛋白质组定量技术的研究和应用

还任重道远。目前定量蛋白质组研究策略主要有：基于双向凝胶电泳的定量蛋

白质组研究策略和基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略等。1.基于双向凝胶

电泳的定量蛋白质组研究策略双向凝胶电泳(2-DE)作为蛋白质组学的主要技术伴随着蛋白质组学的发展而发展，是目前唯一能分离展示大量蛋白质并进行蛋

白质定量分析的一种方法，具有高通量、重复性好、分辨率极高、敏感性较高

等优点，能同时分离和定量数千种甚至上万种蛋白。虽然它有许多不尽如人意

的地方,但依然是蛋白质组研究的一个重要手段，在蛋白质分离和定量分析中显

示其独特的魅力。在传统的双向凝胶电泳上比较两种存在差异表达的蛋白质组样品时，要将其总蛋白分别展现在不同的凝胶上。由于双向凝胶电泳重复性的

问题，每种样品通常需做多次电泳，以获得图像的电子"平均值"，从而使二者

间的比较更有把握。同时，考马斯亮蓝与银染蛋白质点定量上线性动态范围较

窄，为蛋白质点的精确定量比较带来限制。荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)

是在传统双向凝胶电泳基础上发展起来的定量分析凝胶蛋白质点的新方法，其优点是可以在同一块凝胶上比较两种不同来源或不同处理的蛋白质组表达，能

比较精确地在较宽的动态范围内对研究者感兴趣的蛋白质进行定量，因此成为

一种有较好应用前景的定量蛋白质组学研究方法。该方法首先将待比较的几个

样品的总蛋白分别用两种不同的荧光标记试剂(Cy2、Cy3或Cy5)进行标记，然

后将不同荧光染料标记的几种待比较蛋白质等量混合，上样进行双向电泳，2-DE凝胶在成像仪上用不同的波长激发，分别将样品的荧光图谱成像，用2D分

析软件进行定量分析，对差异的蛋白质点用MALDI-TOF-MS或ESI-MS进行鉴定。

荧光差异显示双向电泳(亦称荧光差示双向电泳)与传统的双向凝胶电泳最大的

差别在于前者采用了荧光试剂来标记蛋白质并通过荧光成像以获取电泳图像。

这种方法的优点是可以在同一块凝胶上比较两种不同来源或不同处理样本的蛋白质表达谱，能在较宽的动态范围内精确地对感兴趣的蛋白质进行定量。2.基

于生物质谱的定量蛋白质组研究策略由于不同蛋白质和多肽在质谱仪中离子化

能力不同，质谱仪检测得到的信号对来自单一样品的蛋白质并不具有定量功能，

所以从质谱图中不能得到量的信息。但是对于具有相同离子化能力的蛋白质或

多肽，可以通过比较质谱峰的强度(或峰面积)得到待比较蛋白质的相对量。根

据这一原理发展了基于生物质谱的定量蛋白质组学分析方法。Oda和Gygi等人

最先利用此原理，用一种质量标签标记一种状态下的蛋白质，然后与另一种状态下没有标记的蛋白质混合起来，进行质谱分析，通过比较某蛋白质没有标记

的峰和标记后峰的强弱，就得到这种蛋白质在两种状态下表达量的变化。这里

经常用到的内部标准就是稳定同位素(如2D、13C、18O和15N)标记的小分子，

这些小分子必须满足一定的条件：不同样品来源的肽段标记后化学性质是相同

的；若与高效液相色谱联用，标记后肽段的保留时间要尽可能相同。二、蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质功能模式的研究是蛋白质组研究的最终目标。

其主要研究目标是要揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深

入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关

系。蛋白质翻译后修饰和蛋白质-蛋白质相互作用的研究已成为蛋白质组学的重

要部分。近年来，随着蛋白质组学研究技术的发展，发展了许多有效的功能蛋白质组研究方法，如酵母双杂交系统、噬菌体展示、生物传感芯片质谱、基因

工程和蛋白质工程中的突变表达分析、核磁共振成像、X线晶体衍射分析、蛋

白质芯片技术等。(一)蛋白质翻译后修饰的研究随着后基因组时代的到来和蛋

白质组学技术的迅速发展，对生物体器官、组织或细胞的蛋白质的翻译后修饰

研究已经成为蛋白质组学的一项重要任务。蛋白质在翻译中或翻译后会在氨基酸链上共价结合各种非肽类基团，形成翻译后修饰，这些修饰能影响蛋白质的

物理、化学性质、折叠状态、构象分布、稳定性以及活性，而且翻译后修饰本

身可作为一个附加功能基团发挥作用。生物体能迅速对体内环境变化和外界环

境刺激产生应答反应，这些反应过程靠复杂的调控机制调节，其中大多数调控

机制是由蛋白质的构象变化所介导的。而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构上发生的各种共价修饰来实现的。蛋白质翻译后修饰

包括：糖基化、二硫键的配对、甲基化、乙酰化、羧基化、焦谷氨酸化、蛋白

质降解、S-硝酸化以及ADP核糖基化等二十多种，是蛋白质行使正常生理功能

所必需的。有些修饰基团只出现在蛋白的N端，与氨基酸种类无关；有些却只

出现在某几个氨基酸残基上，与氨基酸位置无关；还有些修饰现象既与氨基酸种类有关，又与其位置有关。这些修饰基团会影响蛋白质的相对分子质量和等

电点，使其在双向电泳胶上偏离其理论位置。蛋白质的翻译后修饰与其活性及

功能状态有关，也与蛋白质所在细胞的种类和生命周期相关。完全理解特定蛋

白质结构与功能的关系需要掌握多方面的信息，而不仅仅是它的氨基酸序列，

翻译后修饰也是非常重要的信息。但是目前蛋白质翻译后修饰的研究面临着以

下困难：其一、被翻译后修饰的蛋白质经常只是很少的拷贝数，因此修饰肽的

检测需要高灵敏度的方法；第二、蛋白质翻译后修饰要求在确定其修饰位点和修饰数目的同时进行定量分析；第三、蛋白质多肽之间的键经常是脆弱的，很

难找到一定的条件使得在修饰状态下进行处理和电离；第四、已经有超过400

种蛋白质翻译后修饰被发现，且所有可能修饰蛋白质序列的测定工作是巨大的。

所以，尽管二维凝胶电泳和质谱等蛋白质组技术不断完善，但是从整体上了解

蛋白质的翻译后修饰正面临着巨大的挑战。随着质谱技术的灵敏度和准确度的大大提高，质谱已经成为分析蛋白质翻译后修饰的中坚力量，目前蛋白质翻译

后的修饰的解析主要采用电喷雾(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)两种质

谱技术。蛋白质的糖基化和磷酸化修饰在生命活动中具有重要的调控作用，是

最常见、最重要的共价修饰方式，是目前蛋白质组中翻译后修饰研究的热点。3.

基于质谱的蛋白质相互作用研究方法蛋白质鉴定是研究蛋白质相互作用的重要步骤，而质谱(mass spectrometry,MS)分析技术的引入是蛋白质鉴定中最重要

的技术突破，它具有高通量、灵敏、准确、自动化等特点，已逐步取代传统的

Edman降解测序和氨基酸组成分析，成为蛋白质鉴定的核心技术，已广泛用于

二维电泳、色谱分离的蛋白质，以及蛋白质复合体的鉴定。基于质谱技术研究

蛋白质相互作用的基本步骤主要由三个部分组成：靶蛋白制备，蛋白质复合体的纯化，蛋白质复合体的质谱鉴定。蛋白质复合体的纯化方法主要有传统的亲

和层析和免疫共沉淀，以及新型的串联亲和纯化(TAP)和生物传感器技术(如

Biacore技术)。根据纯化蛋白质复合体的方法的不同，可将基于质谱的蛋白质

相互作用研究方法分为以下几种。(1)亲和层析耦联质谱技术亲和层析是一种传

统的纯化蛋白质复合体、研究蛋白质相互作用的方法。其基本原理是将某种蛋白质以共价键固定在基质(如琼脂糖)上作为诱饵，让含有与之相互作用的蛋白

质的细胞裂解液通过层析柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高

盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱

技术(MDLC-ESI-MS/MS)鉴定靶蛋白的结合蛋白。这种方法成功的先决条件是能

够得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵(bait)，以及获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质用于质谱鉴定。获得纯度高的相互作用蛋白

质的一个简单方法是利用含靶蛋白的融合蛋白，常用的为谷胱甘肽S转移酶

(glutathione S-transferase，GST)融合蛋白,可以在谷胱甘肽-琼脂糖

(agarose)柱子上纯化相互作用蛋白质。其它的还有蛋白A融合蛋白,可在含