抗HBV最佳反义寡核苷酸片段的体外筛选抗HBV最佳反义寡核苷酸片段的体外筛选摘要：目的寻找抗HBV最佳反义寡核苷酸区段。
方法合成4种互补于HBV不同区段的反义硫代寡核苷酸（asON），加入HBV基因转染的肝癌细胞模型HepG2.2.15，以ELISA法测定HBsAg、HBeAg含量。
结果互补于pre-S2翻2译起始区的asON（序列Ⅰ）抗HBV基因表达作用最强(P<0.02)，对HBsAg、HBeAg的最高表达抑制率分别为66%和91%,针对增强子Ⅱ(ENⅡ)的序列Ⅲ也有较强的抑制作用（52%、56%）。
asON抗HBV作用具有明显时相性，其抑制作用随时间延长而有反跳，且针对增强子Ⅱ的反义序列Ⅲ和针对S基因起始区的反义序列Ⅱ的抑制作用规律相似，并在时相上与序列Ⅰ互补。
结论4种asON 中，序列Ⅰ抗HBV基因表达作用最强，而且序列Ⅰ与Ⅲ或Ⅱ配伍有望成为理想的抗HBV基因药物。
关键词：乙型肝炎病毒；反义寡核苷酸；基因表达Comparison of the anti-HBV effect of various antisenseoligodeoxynucleotidesMA Chunhong（）SUN Wensheng（）LIU Suxia, et al（）Abstract：Objective To explore an effective anti-HBV oligodeoxynucleotide. Methods Four antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides (asON), complementary to different sites of HBV, were synthesized and assayed for their anti-HBV activity in HepG22.2.15 cells with ELISA. Results The oligomer directed against the initiator of pre-S2 (No.Ⅰ) was most effective, with an inhibitory rate of 66% on HBsAg and 91% on HBeAg (P<0.02). The decrease in virus production was time-dependent. The asON, complementary to enhancer Ⅱ (No.Ⅲ), or asON directed against initiator of S gene (No.Ⅱ) together with asON (No.Ⅰ) had an co-inhibition effect on HBV gene expression. Conclusion asON directed against initiator of S gene had a strong inhibition effect on HBV and asON (No.Ⅰ), or asON (No.Ⅰ) together with asON( No.Ⅲ /Ⅱ) had a therapeutic potential in the treatment of patients infected with HBV.Key words：Hepatitis B virus；Antisense；Oligodeoxynucleotides; Geneexpression▲乙型肝炎病毒（HBV）感染可致肝炎乃至肝癌，严重威胁人类生命健康，目前尚无有效治疗方法。
近年来发展的反义核酸技术利用碱基互补配对原则，定向阻断特定基因的复制、转录或翻译，从核苷酸水平破坏病毒，在新一代抗病毒、抗肿瘤药物设计领域中具有巨大发展潜力。
国内外学者以反义寡核苷酸(asON)作为基因封条封闭HBV ，取得良好的抑制效果〔1-3〕。
但由于asON的抑制作用具有序列特异性，如何选择靶位点，设计最佳基因封条，并掌握其抑制作用规律，成为以反义技术抗HBV基因治疗的关键。
我们综合国内外学者的工作，选择设计了4种反义寡核苷酸片段，加入HBV DNA转染的肝癌细胞模型2.2.15)，初步筛选出最佳asON，并对其HBV的作用规律进行了探讨，(HepG2旨在为反义技术用于HBV治疗奠定基础。
材料与方法2.2.15整合有HBV基因组，能转录、翻译HBV基细胞：肝癌细胞系HepG2因，并产生HBsAg、HBeAg和Dane particle。
该细胞株引自北京医药生物研究条所，本室传代培养于含G418和10%胎牛血清的MEM培养基中，37℃ 5% CO2件下，3～4 d换液1次，细胞长满后传代。
当培养上清中HBsAg、HBeAg稳定分泌，且P/N值>5时，用于实验。
试剂：MEM培养基、胎牛血清为GIBCO产品；G418为Sigma产品；HBsAg、HBeAg检测试剂盒为深圳月亮湾公司产品。
反义寡核苷酸的合成：选择互补于HBV的4个基因位点作为研究对象，即：序列Ⅰ针对pre-S2基因（pre-S2）翻译起始区（3 203～3 219）；序列Ⅱ互补于S基因翻译起始区（147～163）；序列Ⅲ针对HBV转录调控成分增强子Ⅱ（ENⅡ）（1 713～1 727）；序列Ⅳ针对X基因起始区（1 373～1 391）；其中序列Ⅲ是我们自行设计的asON，在国内外尚无报道。
同时设置HBV非互补随机序列Ⅴ(5′TTG CCG AGC GGG GTA3′)作为对照，此序列经微机检索与HBV DNA无同源性。
上述寡核苷酸片段由中国军事医学科学院合成，并进行硫代修饰，其纯度>99%。
4/孔接种于96孔板。
第2天细胞贴壁asON对病毒抗原的抑制实验：HepG2后弃培养基，加入含不同浓度反义/正义寡核苷酸MEM培养基，每个浓度设3孔重复，同时设空白对照（不加寡核苷酸）。
作用一定时间后收集上清，以ELISA HBsAg、HBeAg含量。
计算反义核酸对病毒抗原的抑制率。
反义核酸细胞毒性试验：通过细胞计数、细胞活率及细胞形态学观察,了解asON的细胞毒性作用;MTT比色法测定asON对细胞代谢的影响情况。
结果2.2.15细胞经10μmol/L的1．asON抑制病毒抗原表达作用的比较：HepG2反义寡核苷酸一次性作用后,其病毒抗原表达被抑制的情况如表1所示。
序列Ⅰ～Ⅳ均可有效抑制HBsAg、HBeAg的表达，其中除针对S基因起始区的asON （序列Ⅱ）对HBeAg表达的抑制作用稍弱(31%)外,其余针对pre-S2翻译起始区、增强子ENⅡ及X基因起始区的序列（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ）对HBsAg、HBeAg均有较强抑制作用（>50%），尤以针对pre-S2翻译起始区的序列Ⅰ作用最强（P<0.02），对HBsAg、HBeAg表达抑制率分别为66%和91%；互补于ENⅡ的序列Ⅲ与针对X起始区的序列Ⅳ对HBsAg、HBeAg的抑制作用相似，分别为52%、57%和56%、56%；对照序列Ⅴ对病毒抑制作用极弱（<12%）。
2．asON抑制作用的时相性：以10μmol/L的不同序列反义寡核苷酸一次2.2.15，作用后每隔24 h取上清，测抗原含量，持续观察至第性作用于HepG27天。
结果发现asON抗病毒作用具有明显时相性，表现在：①asON出现最佳抑制作用的时间不同，②同一序列反义核酸对HBsAg、HBeAg的最佳抑制作用时间不相同，序列Ⅰ对HBsAg、HBeAg的最高抑制率分别出现在第2、1天（见表1）。
③反义寡核苷酸在持续作用HepG2.2.15的过程中，对病毒基因表达的2抑制作用有双峰现象：在作用的7 d中，各反义序列均出现2次强的抑制作用，即有2个峰值，但不同asON峰值出现时间不同。
我们所做4个序列的第二峰均出现于作用后第5～7天，此时细胞已基本长满，逐渐开始形成集落。
表1 不同反义核酸对HBV基因表达的抑制作用Table 1. Inhibition of HBV gene expression byoligodeoxynucleotidesHIE:Highest inhibitory effect,*：Time of highest inhibitory effect3. 不同反义寡核苷酸抑制作用互补：如1，2所示，在7 d的作用过程中，针对S基因、ENⅡ的反义序列（Ⅱ、Ⅲ）抑制作用规律相似，对HBsAg的抑制峰值出现于5、7 d，对HBeAg的抑制峰值出现于1、6/7 d；而且序列Ⅱ、Ⅲ的抑制作用恰好与序列Ⅰ互补，序列Ⅰ对HBsAg抑制作用在低谷时（4～5 d），序列Ⅱ、Ⅲ的抑制作用达高峰，而当序列Ⅱ、Ⅲ对HBeAg的抑制作用较弱时（5、6 d），序列Ⅰ的作用正处于第二个峰值。
1 不同反义核酸对HBsAg表达的协同抑制作用Fig 1. Co-inhibition of HBsAg by oligodeoxynucleotides2 不同反义核酸对HBeAg表达的协同抑制作用Fig 2. Co-inhibition of HBeAg by oligodeoxynucleotides4. 反义核酸对细胞无毒性作用：以20μmol/L，40μmol/L的反义寡核苷2.2.15，镜下观察显示4种反义序列作用的细胞在形态、数目酸作用于HepG2（总数、活细胞数）较正常无明显变化，MTT结果表明asON对细胞的细胞毒指数<5%,即反义序列对细胞代谢无影响。
讨论反义技术从核苷酸水平破坏HBV，阻断HBV抗原的产生，从而防止由病毒抗原引发的免疫病理对机体造成的伤害，是抗HBV治疗的有效途径。
HBV基因组全长3.2kb，有至少4个开放读码框，如何从中筛选最佳靶位点，设计最佳反义寡核苷酸区段至关重要。
考虑到HBsAg为HBV主要抗原，在其致病机制中有重要地位；pre-S2基因参与HBsAg的编码，同时又是反式激活蛋白；而HBx 的整合与肝细胞癌关系重大〔4〕，而且国内外学者针对S基因、pre-S2、X基因设计的asON对HBsAg、HBeAg均有较好的抑制作用〔2，3，5〕，我们设计合成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，以比较它们对HBV的抑制作用。
另外，我们根据转录调控成份增强子Ⅱ（ENⅡ）设计合成了序列Ⅲ，试通过阻止ENⅡ的作用，使HBsAg、HBeAg 及HBxAg表达量下降。
目前作者尚未见针对该区段设计寡核苷酸的报道。
体外实验表明，合成的4个反义序列对HBsAg、HBeAg表达均有抑制作用，其中针对pre-S2起始区的序列Ⅰ作用最强（P<0.02），尤其是序列Ⅰ对HBeAg 表达的抑制率高达91%，证明序列Ⅰ有效抑制了HBV DNA的复制，是一个理想的抗HBV反义寡核苷酸区段。
