GST_pull_down试验方法

12.GST蛋白的表达和纯化
12.1 GST蛋白的表达
（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。

（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。

（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。

（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。

（5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。

（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。

（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。

（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。

转移至5ml离心管。

（9) 超声破壁
破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。

破壁参数：Frequency:100～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。

加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。

（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。

（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。

离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。

12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry
（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。

（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。

（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。

反复5次。

（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。

12.3 GST融合蛋白的纯化
（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。

（2) 3krpm离心5min，弃上清。

该Sepahrose上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）
（3) 在管中加入离心后的 1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应
30min～60min。

3krpm离心5min，弃上清。

重复该步骤多次，就可以使Sepahrose 上结合6～10ml 裂解液中的GST融合蛋白。

（4) 在管中加入预冷的200μl PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次， 3krpm离心3min，弃上清。

（5) 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST融合蛋白的Sepharose。

（6) 如果用于检测，在Sepharose加入15～20μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。

12krpm离心1min，取上清作SDS-PAGE电泳。

（7) 如果用于pull－down测试，参见pull－down 步骤。

13.pET融合蛋白的表达与纯化
13.1 pET32a融合蛋白的表达
（1) 将表达融合蛋白的质粒转入BL21DE3中。

（2) 挑单克隆于3ml LA培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。

（3) 将种子液稀释于50ml 2×YTG中，使起始OD600为0.1。

（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。

（5) 加入50μl 100mM的IPTG,22℃摇菌培养6小时。

（6）收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃5krpm离心5min，弃上清。

（7) 加入10ml Ni-lysis buffer/管，重悬菌体。

5krpm离心5min，弃上清。

（8) 加入2ml Nilysis buffer/50ml菌液，vortex重悬菌体。

转移至5ml离心管。

（9) 超声破壁
破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80ul蛋白酶抑制剂。

破壁参数：Frequency:100～200w,60s pause20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。

加100μl 20%TritonX100，冰上放置30min。

（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。

（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。

离心（12krpm,1min），取上清作SDS－PAGE电泳，检测表达情况。

13.2 pET32a融合蛋白的纯化
（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl Ni-NTA珠子，4℃，摇床上摇反应30min～60min。

（2) 离心3krpm×5min，弃上清。

该珠子上即结合了pET32a融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）
（3) 在管中加入离心后的 1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～60min。

离心3krpm×5min，弃上清。

重复该步骤多次，就可以使珠子上结合6～10ml 裂解液中的pET融合蛋白。

（4) 在管中加入预冷的200μl Wash buffer（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，洗涤一次，离心3krpm×3min，弃上清。

（5) 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有pET融合蛋白的Ni-NTA。

（6) 加入60μl Elution buffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。

离心3krpmx5min，吸净上清，pET融合蛋即在上清中。

（7) 如果用于检测，取1～2μl样品，配成15～20μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。

离心12krpm×1min，取上清作SDS-PAGE电泳。

（8) 如果用于pull down测试，参见pull down 步骤。

14.体外蛋白质结合分析
（1) 将结合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B悬浮在500μlNETN 缓冲液中加入20～30μl含有其他蛋白的溶液，例如pET发酵的产物,细胞表达的产物等，同时采用结合有GST空蛋白的Glutathione Sepharose 4B平行操作作为对照。

（2) 在水平摇床上，4晃动4～8小时。

（3) 离心（3.6krpm,2min）。

吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose. （4) 加入200μl缓冲液H对Sepharose进行洗涤。

注意加入缓冲液H时要贴壁加，不要直接冲击Sepharose，随后轻柔晃动，使Sepharose重悬即可。

（5) 低速离心（3krpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose。

（6) 重复步骤的洗涤2～3次。

（7) 吸干Sepharose上方的水层后，加入20～30μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于－20℃。

（8) 做SDS-PAGE和Western检测另一个蛋白。

GST pull down与IP之间区别：
Co-IP 一般来说是证明两个蛋白的相互作用，但不排除通过第三个蛋白介导的间接相互作用。

GST pull down 一般可用来证明直接的相互作用。

GST pull down也并非都是原核表达来源，真核也可以表达作为饵蛋白
GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。

其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

此方法简单易行,操作方便。

GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
GST:体外纯化蛋白，预测有相互作用的蛋白放在一起（EP管中）证明二者是否有直接相互作用。

体外可能相互作用，但在体内不一定相互作用。

IP：体内（细胞内证明）两种蛋白是否相互作用，但二者不一定直接作用，可能通过桥梁作用在一起（间接作用）。