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荧光分析法的基本原理
荧光分析法是一种常用的分析化学方法，它利用物质在受到激发后发出的荧光
来进行定量或定性分析。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，因此在生物医学、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
荧光分析法的基本原理是物质受到激发后发出的荧光强度与其浓度成正比。
当
物质受到特定波长的激发光照射后，其中的分子会吸收能量并处于激发态，随后分子会自发地返回基态并释放出能量，这种能量以荧光的形式发射出来。
荧光分析法利用荧光强度与物质浓度的关系来进行分析，通过测量样品的荧光强度，可以间接地推断出样品中目标物质的浓度。
荧光分析法的基本原理还包括激发光源、激发光和荧光检测器。
激发光源通常
采用紫外灯或激光器，用于提供足够的能量来激发样品中的分子。
激发光是指对样品进行激发的光线，其波长通常由样品的特性决定。
荧光检测器则用于测量样品发出的荧光强度，并将其转化为电信号进行处理和分析。
在实际应用中，荧光分析法可以应用于各种领域。
在生物医学领域，荧光分析
法可以用于检测生物标记物、药物浓度、蛋白质含量等，具有灵敏度高、特异性强的优点。
在环境监测领域，荧光分析法可以用于检测水体中的重金属离子、有机物污染物等，能够快速、准确地进行分析。
在食品安全领域，荧光分析法可以用于检测食品中的添加剂、农药残留、重金属等有害物质，为食品安全提供可靠的分析手段。
总之，荧光分析法作为一种灵敏度高、选择性好的分析方法，具有广泛的应用
前景。
通过深入理解荧光分析法的基本原理，结合实际应用需求，可以更好地利用这一分析方法，为各个领域的分析工作提供更加准确、快速、可靠的支持。
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
化学分析中的荧光分析法基础原理荧光分析法是一种广泛应用于化学分析中的方法。
它利用物质在吸收能量后会发生荧光现象的特性，来测定样品中所含物质的质量浓度、元素组成等信息。
荧光分析法有很多种，其中最常见的是荧光光谱分析法和荧光化学分析法。
本文将重点介绍这两种方法的基本原理及其在化学分析中的应用。
荧光光谱分析法荧光光谱分析法是基于研究物质在吸收外部能量（通常是光能）后所发出的荧光现象。
荧光分析的关键是光谱，而荧光光谱是物质吸收光后所产生的荧光强度与波长之间的关系图。
通常情况下，荧光光谱会产生波峰和波谷，其中波峰对应着荧光峰，荧光峰的位置、强度以及荧光的寿命都可以直接反映出物质的成分、组成、形态等性质。
荧光光谱分析法是一种非破坏性的检测方法，对样品的破坏仅仅是因为光的吸收引起样品的发光。
虽然这种方法与分子的单重态和三重态的能级有关，然而它依然是一种化学分析方法，因为荧光分析法的结果是由物质的成分和结构来决定的。
荧光光谱分析法非常适用于分析质量浓度比较低，并且需要分析多个成分的样品。
荧光化学分析法除了荧光光谱分析法以外，荧光化学分析法也是一种常见的荧光分析方法。
这种方法是利用荧光物质和待测物质结合形成荧光物质-待测物质复合体，进而检测出待测物质的浓度。
荧光化学分析法常用于分析有机化合物、生物大分子以及环境中的污染物等。
荧光化学分析法可以通过两种方式进行：荧光标记法和荧光敏感材料法。
荧光标记法是把荧光酶、荧光染料或者其他荧光探针标记到待测物质上，形成荧光检测体系。
这种检测方式是在分子水平上实现的，因此具有足够高的灵敏度并且避免了直接接触待测物质的问题。
荧光标记法在生物化学、生物医学等领域都得到广泛的应用。
荧光敏感材料法是基于荧光材料敏感性对待测物质的反应来进行的。
这种方法利用化学或生物体系使荧光物质发生特定的荧光变化，从而检测待测物质的浓度。
荧光敏感材料法依靠荧光物质的基质，具有选择性和快速性，并且对待测物质有更加广泛的适用性。
紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。
它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。
二紫外光谱的产生物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。
一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。
分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子：（1）形成单键的σ电子；（2）形成双键的π电子；（3）分子中非键电子即n 电子。
化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：（σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ* ）σ,π是成键轨道，n 是非键轨道，σ* ,π* 是反键轨道由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。
即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。
二紫外光谱的表示方法紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。
横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。
纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。
吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。
曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。
四、紫外光谱中常用的几个术语1.发色基团和助色基团发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。
一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等）助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。
荧光分析法的基本原理荧光分析法是一种常用的分析技术，它利用样品在受到激发光照射后发出的荧光信号来进行分析。
该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，在生物医药、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
荧光分析法的基本原理是基于物质在受到激发光照射后会发出荧光的特性。
当分子处于基态时，吸收一定波长的激发光后，电子跃迁至激发态，再从激发态返回基态时会放出荧光。
荧光分析法利用这一原理，通过测量样品在受到激发光后发出的荧光强度来确定样品中所含物质的种类和含量。
在荧光分析法中，激发光源会激发样品中的分子，使其处于激发态，然后测量样品发出的荧光信号。
荧光信号的强度和波长分布可以提供关于样品成分和结构的信息。
通过测量样品的荧光强度和波长分布，可以对样品中的化合物进行定性和定量分析。
荧光分析法的基本原理包括激发和发射两个过程。
激发过程是指样品受到激发光照射后，分子从基态跃迁至激发态的过程；发射过程是指分子从激发态返回基态时发出荧光的过程。
荧光分析法利用这两个过程进行分析，可以实现对样品中微量物质的高灵敏度检测。
荧光分析法的灵敏度高，可以检测到样品中极微量的物质。
同时，荧光分析法具有良好的选择性，可以通过选择合适的激发光源和检测波长，对不同物质进行区分和分析。
此外，荧光分析法的操作简便，只需一台荧光分析仪和相应的荧光标记剂即可进行分析，无需复杂的前处理步骤，适用于现场快速检测和大样品量分析。
总之，荧光分析法是一种灵敏度高、选择性好、操作简便的分析技术，具有广泛的应用前景。
随着荧光标记技术和荧光分析仪器的不断发展，荧光分析法将在生物医药、环境监测、食品安全等领域发挥越来越重要的作用。
紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。
它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。
紫外光谱的产生物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征) 。
一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。
分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子： (1)形成单键的c电子；(2)形成双键的n电子；(3) 分子中非键电子即n电子。
化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：(c)v(n)v( n) v(n * )v( c * ) c，冗是成键轨道，n是非键轨道，c* , n *是反键轨道由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。
即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。
紫外光谱的表示方法紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的横坐标表示吸收光的波长，用nm （纳米）为单位。
纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用 A （吸光度）、T （透射比或透光率或透过率）、 1-T （吸收率）、?（吸收系数）中的任何一个来表示。
吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。
曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置, 纵坐标为它的吸收强度。
250A /nm翠腔的紫外光谨图 四、紫外光谱中常用的几个术语1. 发色基团和助色基团发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色 都称为发色基团。
一般不饱和的基团都是发色基团（ C=C C=O N=N、三键、苯环等）200 3001.振动驰豫助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。
助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成（-NH2 , -NR 2, -OH -OR , -Cl等），这些基团借助P- n共轭使发色基团增加共轭程度，从而使电子跃迁的能量下降2 •红移、蓝移、增色效应和减色效应由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。
与此相反，如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动，则称为蓝移。
由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响，使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、分子荧光分析法、荧光的产生物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。
分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快, 大约10-15s），成为激发单重态分子。
激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态丁. ：》.*览空式损失部分能量, 从这一过程只彳能页3较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。
由于这一部分能量以热的形式释放, 而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射跃迁。
2. 内转换即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。
内转换也属于无辐射跃迁3. 系间窜跃有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间窜跃。
对于大多数物质，系间窜跃是禁阻的。
如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容易了4. 磷光经系间窜跃的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级，停留一段时间（10-4〜10 s，称作磷光寿命），然后以光辐射形式放出能量返回到基态各振动能级，这时发出的光称为磷光（phosphoresce nee ）。
由于激发三重态能量比激发单重态最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，即磷光的波长比荧光更长。
5、1/. 荧光较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 s，称作荧光寿命），以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为荧光。
当然也可以无辐射跃迁形式返回基态、激发光谱和荧光光谱荧光检测光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。
样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的荧光强度F。
由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。
激发光谱与荧光发射光谱的形成任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和荧光发射光谱（fluorescence emission spectrum）。
1. 激发光谱保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度 F （即激发光波长扫描）。
然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。
激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。
物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。
2. 荧光光谱荧光光谱，又称发射光谱。
保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。
以发射波长为横坐标，以荧光强度F 为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。
荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长发射光谱与激发光谱的关系1. 发射光谱形状与激发光波长无关由于荧光是分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态的各振动能级时释放的光辐射，与分子被激发至哪一个电子激发态无关。
2. 发射光谱比激发光谱波长为长由于分子吸收激发光被激发至较高激发态后，先经无辐射跃迁（振动驰豫、内转换）损失掉一部分能量，到达第一电子激发态的最低振动能级，再由此发出荧光。
因此，荧光发射能量比激发光能量低，发射光谱波长比激发光波长长。
3. 镜像对称对于高度对称的有机分子，其荧光发射光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
解释：能级结构相似性荧光为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个振动能级而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。
激发光谱是由基态最低振动能级跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能级而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。
由于激发态和基态的振动能级分布具有相似性，因而呈镜像对称。
、影响荧光产生及荧光强度的因素1. 物质产生荧光的必要条件一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低，与它的分子结构及所处的环境密切相关。
能够发射荧光的物质都应同时具备两个条件：1. 物质分子必须有强的紫外吸收（有？〜?*跃迁）；2. 物质具有较高的荧光效率（fluorescence efficiency ）。
荧光效率也称荧光量子产率，用?f 表示。
可见，凡是使k F增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。
通常，k F由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。
2. 影响荧光及其强度的因素跃迁类型：如上所述，物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光效率才能产生荧光。
具有?—?* 跃迁的分子才有强吸收。
?—?* 跃迁的?大。
共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，具有共轭的?〜?* 跃迁。
其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，且最大激发和发射波长都向长波长方向移动，如苯、萘、刚性平面结构：当荧光分子共轭程度相同时，分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大荧光物质（荧光素）非荧光物质（酚酞）芴（①=1.0 ）联苯（①=0.2 ）有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。
如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg+、A|3+等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。
8-羟基喹啉8- 羟基喹啉-铝取代基团荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都有很大影响。
给电子取代基如一NH、一OH —OCH—CN —NHR —NR等，能增加分子的n电子共轭程度，使荧光效率提高。
而-COOH —NO、—C=O —F、—Cl等吸电子取代基，可减弱分子n电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。
还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如一R、一SOH —NH 等。
温度温度对被测溶液的荧光强度有明显的影响。
当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。
故降低温度有利于提高荧光效率及荧光强度。
由于荧光仪器光源的光强度大、温度较高，容易引起溶液温度升高，加之分析过程中室温可能发生变化，从而导致荧光强度改变。
另外，有些荧光物质的溶液在激发光较长时间的照射下，还会发生光分解，使荧光强度下降。
因此，试样不应长时间受光照射，只在测定荧光强度时才打开光闸，其余时间应关闭。
在较高档的荧光分光光度计中，样品室四周设有冷却水套或配有恒温装置，以使溶液的温度在测定过程中保持恒定。
溶剂：同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和荧光强度可能会有一定的差别，尤其是那些分子中含有极性取代基的荧光物质，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。
溶剂的影响可以分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。
一般溶剂效应是指溶剂极性的影响。
通常情况下，随着溶剂极性增大，？〜?*跃迁所需的能量差?E减小，跃迁几率增加，从而使荧光波长长移，荧光强度增大。
一般而言，探针激发态的偶极矩大于基态偶极矩，当荧光基团被激发后，溶剂的偶极子在激发态的荧光基团的周围重新定向而降低激发态的能量，溶剂的极性越大，荧光团激发态能量降低的越多，因而从激发态跃迁回基态时发射的能量越低，发射的波长就越长特殊溶剂效应是指溶剂与荧光物质形成化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态改变，使荧光峰的波长和荧光强度都发生较大变化。
如在萘胺的乙醇溶液中加入盐酸，随着溶液中盐酸浓度的增加，萘胺的—NH2 基逐渐被—NH3Cl 基所代替，而—NH3Cl 基对萘环特征频率的影响小于一NH,因此溶液的荧光光谱趋近于萘的荧光光谱。
pH值：溶液的酸度(pH值)对荧光物质的影响可以分两个方面：1．若荧光物质本身是弱酸或弱碱时,溶液pH 值改变,物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化,而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。
