荧光分光光度法
一、 实验目的
1、学习荧光分光光度法的基本原理；
2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法；
3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。
二、 实验原理
荧光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS ）通常又叫荧光分析法，具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点，已成为一种重要的痕量分析技术。荧光（fluorescence ）是分子吸收了较短波长的光（通常是紫外光和可见光），在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。由此可见，荧光是一种光致发光。
任何荧光物质都有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum ）和发射光谱（emission spectrum ）或称荧光光谱（fluorescence spectrum ）。激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱时，将发射单色器固定在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度对激发波长的关系曲线，即为激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。绘制荧光光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。
荧光强度（F ）是表征荧光发射的相对强弱的物理量。对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，即
该式即荧光分光光度法定量分析的依据。使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。 三、
仪器与试剂 F-4500荧光光谱仪；比色管（10mL ）；牛血清白蛋白（BSA ）
四、 实验内容
1、 开机准备：接通电源，启动电脑。打开光谱仪主机电源，预热15分钟。
2、 运行FL solution 软件，设定检测方法和测量参数：
EX （激发波长）：280nm
EM （发射波长）：340nm
EX 扫描范围：210nm ～330nm
EM 扫描范围：290nm ～450nm
EX 缝宽：2.5nm ，EM 缝宽：2.5nm
扫描速度：240nm/min
PMT 电压：700V
3、 激发光谱和发射光谱的绘制：
先固定激发波长为280nm ，在290～450nm 测定荧光强度，获得溶液的发射光谱，在343nm 附近为最大发射波长λem ；再固定发射波长为λem ，测定激发波长为200nm ～λem 时的荧光强度，获得溶液的激发光谱，在280nm 附近为最大激发波长λex 。
4、 退出FL solution 软件，关闭光谱仪主机电源，关闭计算机。
Kc
F
五、 数据处理
以荧光强度为纵坐标，波长为横坐标，分别绘制激发光谱和发射光谱。
发射光谱图 280300320340360380400420440460
200
400
600800
1000342nm
i n t e n s i t y wavelength/nm
激发光谱图
200220240260280300320340
200
400
600800
1000
283nm i n t e n s i t y wavelength/nm
由图可知，发射波长为342nm ，激发波长为283nm 。
六、 思考题
1、 画出荧光光谱仪的基本结构图。
2、荧光光谱仪与紫外光谱仪在结构上有何不同？为什么要这样设计？
答：紫外光谱仪的检测器与单色器在一条直线上，测的是透射光；而荧光光谱仪的检测器与单色器成90度角，测的是物质发射光，这样可以减少或者消除背景干扰，提高灵敏度。
3、如何绘制激发光谱和发射光谱曲线？
答：先固定激发波长为一波长λ1（一般为340nm），在λ1～700nm测定荧光强度，获得溶液的发射光谱，在图上找出最大发射波长λem；再固定发射波长λem，测定激发波长为200nm～λem时的荧光强度，获得溶液激发光谱，找出激发波长λex。可以在仪器上显示出激发光谱和发射光谱曲线，也可以将实验数据的TXT文档在Origin软件里面进行处理得到激发光谱和发射光谱曲线。
