血疟原虫检检查标准操作规程

疟原虫检验技术梁平县疾病预防控制中心何曦血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重要部分，血涂片制作和染色的好坏足心影响检查的结果，必须把握好“三关”，即制片、染色和镜检。

一、玻片清洁玻片清洁。

清洁的玻片无油脂，无划痕，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落，薄血膜涂布不均匀。

在用手指持玻片时，只能夹持玻片的两侧边缘，不要接触玻片的表面，以避免手指上的油污染污玻片。

1.新的载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清水冲洗，然后用软而洁净的毛巾擦干待用。

2.使用过的载玻片的清洁方法有两种：①5%的肥皂水煮沸法：将洗衣肥皂削成小片，加水配成约5%的肥皂水，煮沸后将玻片一张一张地平放进肥皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂水稍冷后，用清洁干毛巾擦净后待用。

②清洁液浸泡法：清洁液配制如下：重铬酸钾 80g浓硫酸 100ml水(清净水)1000ml配制时须先将重铬酸钾研细放入水中，慢慢加温到全部溶解为止，然后缓缓加入浓硫酸，待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。

清洁玻片时，将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一两天后，取出清水冲洗至完全没有黄色为止。

浸泡前最好用二甲笨除去镜油，清洁液颜色变为墨绿色后即失去清洁作用，不能再用。

二、制片1.薄血膜涂制：(1)先用75%酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。

(2)用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方向将耳垂轻轻挤压出血。

(3)取一张洁净的载玻片，将它的左1/3的表面接触耳垂上的血滴（不要将玻片接触耳垂上的皮肤），使一小滴血在玻片上。

血量1-1.5mm3 .1/4.火柴头大小。

(4)将推片臵于血溶之前与血液相接触，待血液沿推片边缘展开后，将推片与载玻片保持30角度，用力均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。

涂制得较好的薄血膜只有一层血球，血球的分布排列比较均匀，血膜的末端突出如舌状。

若取的血滴太大，则涂制的血膜太宽太厚；若推时用力不均匀，则易成梯田状，若用力太大，则血膜两端过厚，若涂片上有油污，则血膜成多孔状。

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法ICS11.020C62WS 中华⼈民共和国卫⽣⾏业标准WS/T 569—2017疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法Microscopic examination of blood films for malaria parasites2017-08-01发布2018-02-01实施前⾔本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。

本标准起草单位：海南省疾病预防控制中⼼、江苏省寄⽣⾍病防治研究所、中国疾病预防控制中⼼寄⽣⾍病预防控制所、云南省寄⽣⾍病防治所、海南省农垦总局医院。

本标准主要起草⼈：王善青、⾼琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李⾬春、刘莹、欧阳范献。

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法1 范围本标准规定了⾎涂⽚镜检法检测疟原⾍的技术规范。

本标准适⽤于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原⾍的显微镜检测。

2 术语和定义下列术语和定义适⽤于本⽂件。

2.1疟原⾍Plasmodium spp疟原⾍是⼀类单细胞、寄⽣性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。

寄⽣于⼈体的疟原⾍主要有恶性疟原⾍（Plasmodium falciparum）、间⽇疟原⾍（Plasmodium vivax）、三⽇疟原⾍（Plasmodium malariae）和卵形疟原⾍（Plasmodium ovale）等。

2.2⾎涂⽚ blood films将⾎液涂制于载玻⽚上制成的涂⽚。

供显微镜疟原⾍检查⽤的⾎涂⽚包括厚⾎膜涂⽚和薄⾎膜涂⽚两种。

3 仪器和器材3.1 ⽣物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×⽬镜）。

3.2 计数器。

3.3 载玻⽚（⽆划痕⽆油污的洁净载玻⽚）。

3.4 推⽚。

3.5 ⾎⽚染⾊架。

3.6 ⾎⽚⼲燥架。

3.7 玻⽚盒。

3.8 染⾊盘和染⾊缸。

4 试剂和材料4.1 吉⽒染⾊原液。

4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。

4.3 甲醇（分析纯）。

4.4 ⾹柏油或专⽤浸油（折射率≥1.5）。

疟原虫检测检测标准操作程序1. 检验目的与原理1.1检验目的：检查血液中是否有疟原虫。

1.2 检验原理：瑞氏染色原理：瑞氏染料中含有美蓝和伊红两种染料，前者为碱性，后者为酸性，它们与细胞内的各种物质具有不同的亲和力，使其显现出不同的色调，以便于辨认。

根据瑞氏染色的酸碱物质染色性不同，可讲疟原虫各期的形态进行清楚染色，便于观察，高倍镜下一般可以观察到各种类型的疟原虫（常见间日疟、三日疟、恶性疟），疟原虫的各期，如环状体（早期滋养体），晚期滋养体，裂殖体、配子体等。

2. 样本收集和贮存2.1原始样本系统：全血。

2.2标本类型：EDTA抗凝血2ml,标本的采集应使用标准一次性采血管，充分混匀，勿震荡。

2.2保存条件：EDTA抗凝血尽快即时检测。

2.4病人要求：必须是发烧时采血。

3．试剂3.1瑞氏染液：3.1.1试剂成分：瑞氏染料 1.0g无水甲醇500ml甘油10ml3.1.2瑞氏染液配制方法：将瑞氏染料称量好后，放在乳钵中加少量无水甲醇匀速研磨至溶解，将研磨好的染液倾倒入试剂储存瓶中，倒入无水甲醇继续研磨，反复多次，直至乳钵中无瑞氏染料沉淀为止，染液试剂瓶存满为止。

将配制好的染液放在37℃24小时后方可使用，放在阴凉干燥处，避光保存。

3.2磷酸盐缓冲液PH6.43.2.1 脱水Na2HPO4 1份: 处理方法将Na2HPO4于蒸发皿上干燥(火燃烘烤）成粉末称量。

3.2.2无水KH2PO4 2.6份将脱水Na2HPO4 1份和水KH2PO4 2.6份充分混合，边研磨边混匀。

3.2.3将上述粉末1g加溶解于500ml去离子水中，混合均匀，方可使用。

3.3 器材：载玻片、加样枪、吸头、推片器4. 仪器显微镜 OLYMPUS 型号：CX21。

4.1开机前检查4.1.1 OLYMPUS显微镜：检查显微镜光路系统，目镜、物镜镜头正常，聚光器、光圈、螺旋、微螺旋调节正常。

4.2日维护：每日清理纤维镜表面，保持显微镜光圈、聚光器干净整洁；每日下班前无水乙醇（二甲苯少用，有致癌性）清洗所有显微镜物镜（低倍镜10，高倍镜油镜）、目镜。

疟原虫检验技术1）薄血膜（thin blood film）制作方法（1）采血：临床上取病人耳垂或指尖血（2）操作方法：取病人末梢血1滴，置载玻片的中部，使推片和玻片保持30～40度夹角，将血滴在推片边缘展开后，匀速向前推动，即形成舌状血膜。

2）厚血膜（thick blood film）制作方法（1）采血同薄血膜法（2）操作方法：厚血膜可置于薄血膜的另一端。

取病人末梢血2-3滴，自里向外顺着一个方向徐成直径约1cm大小，厚薄均匀的血膜。

厚、薄血膜间用蜡笔画线分开。

充分晾干后，滴加蒸馏水于厚血膜上溶血，将水倾去，晾干后与薄血膜一起染色。

3）固定、染色（1）瑞氏染色：先用蜡笔在血膜两端划上线，以防染液外溢。

瑞氏染液为甲醇溶液，血膜不需预固定、此染色法快速，适于临床检验，但较易褪色，保存时间不长。

滴加瑞氏染液数滴，使之覆盖血膜，约1～2min后血膜被染液中的甲醇固定，再加与染液等量的缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使染液与稀释液混匀，3～5min后用缓冲液或自来水从玻片一端冲洗，晾干后镜检。

4）注意事项(1）玻片要洁净，无油脂。

血量适中，推速均匀，以防血膜过厚、过薄或出现条状横纹。

血片在干燥过程中，避免灰尘或苍蝇脱吸。

(2）厚薄皿膜制备在一张载玻片时，应注意在厚血膜溶血前必须先用甲醇固定薄血膜，以避免接触水而使薄血膜上的红细胞溶解。

厚血膜溶血时间不可太长，不要振荡，以防血膜脱落。

(3）染液是甲醇溶液，切忌混入水滴，否则发生沉淀，妨碍染色，故染液发现有沉淀时不可再用。

(4）滴加染料切忌太多，否则染料残渣粘在血膜上无法洗净，影响检查。

加水后必须与染料充分混合，否则发生染色不均。

冲洗血膜时应流水直接将染液冲去，避免染料粘着血膜。

疟原虫镜检血片制作与染色操作流程
1．填写登记表在“疟疾发热病人血检登记本”上为患者编号并登记其相关信息。

2．清洁玻片
3．玻片编号用目测法将玻片分成六等分，左侧第一和等二等份用于编号。

同一患者玻片上号码应与登记本上一致。

4．采血
5．涂制厚厚片
（1）血量: 4～5微升
（2）位置：玻片第三等份中央的位置
（3）血膜大小：0.8～1.0厘米
6．涂制薄血膜
（1）血量: 1～1.5微升
（2）位置：玻片第四至第六等份的位置。

涂制薄血膜的血应滴在玻片中央稍偏右的位置
（3）血膜大小：2.0厘米(宽)×2.5厘米(长)
7．吉氏染色液配制
（1）2%的吉氏染色液配制方法98毫升蒸馏水加入2毫升吉氏原液，混匀后即为2%的吉氏染色液。

也可用1支试管，按1毫升蒸馏水加入1滴吉氏原液的比例稀释染液，混匀后用于染色。

（2）注意事项2%的吉氏染色液必须现配现用。

8．吉氏染色方法
（1）待厚血膜干燥
（2）甲醇固定薄血膜
（3）待甲醇挥发干净
（4）滴2%的吉氏染液覆盖厚薄血膜，染色30分钟。

（5）取出染好的血片，连同染液在清水中轻轻漂洗一遍，洗去表面吸附的杂质。

（6）放置干燥处晾干。

血膜面朝上，注意不要放反了。

附件3疟原虫血涂片镜检技术规范一、吉氏液染色--光学显微镜（油镜）检查同时涂制薄血膜和圆形厚血膜，薄血膜须用甲醇固定，用吉氏染色液（Giemsa stain）进行染色。

吉氏染液用pH7.0-7.2的水配成3%的稀释液，可将血片插入染色缸内染色，或用滴管将稀释液滴在厚、薄血膜上，染色30min，若需快速染色，可在2ml水中加吉氏染液3滴，染色6min 。

对临床诊断为脑型疟者，宜用快速染色法，以便能尽快获得确诊依据。

现症患者至少检查100个厚血膜视野，带虫者应查完整个厚血膜，未发现疟原虫才判为阴性。

薄血膜可用于原虫形态鉴定。

以薄血膜中平均每100个红细胞中的原虫数，或厚血膜中平均每100个白细胞范围内的原虫数，推算每微升血中的原虫密度。

染色血片中的原虫核呈红色，胞浆呈兰色。

除环状体外，其他各期均可查见褐色的疟色素。

除恶性疟病例外，均可查见各期疟原虫。

一般恶性疟病例，仅查见环状体，或可见配子体。

但脑型疟病例，不仅原虫密度高，查见的环状体比一般的粗大，而且可查见大滋养体和裂殖体，疟色素呈黑褐色，这些特点对明确诊断很有帮助。

还有一点值得注意，在非洲感染的非重症恶性疟病例，其环状体往往比国内一般恶性疟病例所见的环状体粗大，胞浆较多，与间日疟原虫小滋养体相似，容易误判为间日疟原虫，但也不能同时查见大滋养体和裂殖体，这一点有别于间日疟原虫感染。

二、瑞氏液染色-光学显微镜（油镜）检查同时制作厚、薄血膜，用瑞氏染液（Wright stain）进行染色。

在厚血膜上加清水2-3滴溶去血红蛋白，染色效果较好。

染色时，先在薄血膜上直接加约1ml瑞氏液染色2min，然后在薄血膜上加与染液等量的水稀释，并引到厚血膜上共染5-6min。

其他参见吉氏液染色法。

三、荧光素吖啶橙染色-荧光显微镜检查要求涂制成直径为1.2-1.5cm的亚厚血膜，不宜过薄。

须用甲醇固定薄血膜，用清水溶去厚血膜的血红蛋白。

吖啶橙1g加pH6.5-7.0磷酸缓冲液100ml配制成1%吖啶橙母液。