高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化

傅科鹤，范莉莉，陈慧颖，等．高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０２１，４９（３）：２１４－２１８．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２１．０３．０３８

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化

傅科鹤１，２，范莉莉１，２，陈慧颖１，黄　颖１，张同林１

（１．南昌师范学院生物系，江西南昌３３００３２；２．地方鸡种遗传改良省级重点实验室／南昌师范学院生物技术研究所，江西南昌３３００３２）

摘要：纤维素是自然界中分布最广泛的一种生物质能源，筛选能够高效降解纤维素的菌株对于开发利用这类物质具有重要意义。从土壤中分离纯化获得一株高产纤维素酶的菌株ＴＷ０６３－３，通过形态学结合分子生物学鉴定得出，该菌株为草酸青霉。通过单因素优化试验寻找最佳培养条件，然后通过正交试验确定关键因子的最佳参数。筛选得出最佳培养条件：１５ｇ／Ｌ羧甲基纤维素钠＋２ｇ／Ｌ硝酸铵，ｐＨ值为３．０，２００ｒ／ｍｉｎ培养６ｄ。在最佳培养条件下，酶活性比优化前提高了３４．１％，达到５２４．４Ｕ／ｍＬ。研究结果可为生物降解纤维素酶提供一定的理论及应用价值。 关键词：纤维素酶；草酸青霉；培养基优化 中图分类号：Ｓ１８２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２１）０３－０２１４－０５

收稿日期：２０２０－０３－１０基金项目：江西省教育厅项目（编号：１５１２５２、ＧＪＪ１６１２３３）；国家自然科学基金地区项目（编号：３１６６００２０）。作者简介：傅科鹤（１９７６—），男，江西南昌人，博士，讲师，主要从事微生物土壤修复研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｈｆｕ０１１２＠１６３．ｃｏｍ。通信作者：范莉莉，博士，讲师，主要从事木霉菌分子遗传研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｌｆａｎ３１＠１６３．ｃｏｍ。 纤维素酶能够将自然界中最丰富的生物质能

源———纤维素类物质分解成可溶性单糖，从而为大

批量生产生物燃料乙醇提供廉价原料［１］。经过５０

多年的研究发现，纤维素酶已经成为第四大工业酶

种［２］，在生物能开发、食品、畜牧业及工农业废弃物

回收等多个领域都具有远大的应用前景［３］。

已有研究发现，自然界中能分解纤维素的生物

类群主要是细菌与真菌［４］。丝状真菌是产纤维素

酶非常重要的一大类群，能够产生多种胞外纤维素

酶［５］。里氏木霉是研究得较为清楚的产纤维素酶

菌株，但是其生长量相对较小，产酶量不能满足工

业中转化纤维素的需求［６］。许多研究发现，青霉菌

具有胞内分泌组分齐全、纤维素酶活性高、易培养

和生长速度快的优势［７］，而且青霉源纤维素酶能产

生比木霉源纤维素酶较多的β－葡萄糖苷酶［８］。

本研究从海滩边土壤筛选获得一株高产纤维

素酶的青霉菌株，通过优化培养条件，旨在提高该

菌株的纤维素酶产量，研究成果可为今后工业化应

用纤维素酶提供一定的理论依据。

１　材料与方法１．１　材料

１．１．１　刚果红筛选培养基　培养基配方为１０ｇ／Ｌ羧甲基纤维素钠，０．２ｇ／Ｌ刚果红，２ｇ／ＬＫ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ，０．０１ｇ／ＬＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．５ｇ／ＬＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．５ｇ／ＬＫＣｌ，１４ｇ／Ｌ琼脂。１．１．２　摇瓶发酵培养基　培养基配方为１０ｇ／Ｌ羧甲基纤维素钠，３ｇ／Ｌ蛋白胨，０．５ｇ／Ｌ酵母粉，４ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４，２ｇ／ＬＫ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ，０．３ｇ／ＬＣａＣｌ２，０．５ｇ／ＬＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，２ｇ／Ｌ吐温－８０。１．２　方法

１．２．１　样品采集与处理　土壤样品从海洋和森林中采集，取５点采样，混合为１个样品。在样品中加入适量纯净水后，加玻璃珠打散，取上层液体，稀释后涂板筛选。１．２．２　纤维素酶活性的测定　采用ＤＮＳ（３，５－二硝基水杨酸）法测定纤维素酶活性。对照（ＣＫ）处

理方法：取１ｍＬ菌液，煮沸（１００℃、５ｍｉｎ）灭活后用冷水冷却５ｍｉｎ，之后加入１ｍＬ１％羧甲基纤维素钠溶液和３ｍＬＤＮＳ，混合均匀后沸水（１００℃、５ｍｉｎ）水浴，再用冷水冷却５ｍｉｎ，然后在波长（λ）为５４０ｎｍ的紫外－可见分光光度计中测吸光度。

酶活性的测定：取１ｍＬ菌液，加入１ｍＬ１％羧甲基纤维素钠溶液，混合均匀后在３７℃水浴锅中水浴３０ｍｉｎ，煮沸（１００℃、５ｍｉｎ）灭活后用冷水冷却５ｍｉｎ，再加入３ｍＬＤＮＳ溶液，混合均匀后沸水（１００℃、５ｍｉｎ）水浴，再用冷水冷却５ｍｉｎ。每组测

定吸光度前用其对应的ＣＫ清零后再测定５４０ｎｍ处的吸光度，每瓶设３次重复。酶活性单位的定义：—４１２—催化产生１μｇ葡萄糖的酶量为１Ｕ［９］。

酶活性（Ｕ／ｍＬ）＝Ｄ５４０ｎｍ×ｎ×１０００／Ｋ。

式中：ｎ为稀释倍数；Ｋ为标准曲线斜率。

１．２．３　高产纤维素酶菌株的筛选　将菌株活化后

接种至刚果红初筛平板上，于２８℃恒温培养箱中培

养。待初筛获得的高产漆酶菌株活化产孢后，用３

层擦镜纸过滤获得孢子，稀释至１×１０４个／ｍＬ，在每

瓶培养基（２５０ｍＬ三角瓶装量５０ｍＬ）中接入１ｍＬ

孢子悬液，２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养５ｄ后测定酶活性。

１．２．４　发酵产酶条件的优化

１．２．４．１　碳源的优化　对经摇瓶复筛得到的最佳

菌株进行培养基的优化，其中发酵培养基的碳源分

别取１０ｇ／Ｌ羧甲基纤维素钠、１０％葡萄糖、１０％淀

粉、１０％蔗糖进行筛选，其余条件不变，发酵５ｄ后

测定酶活性，确定最佳碳源。

１．２．４．２　氮源的优化　将发酵培养基的碳源改为

最适碳源，分别取２ｇ／Ｌ硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝

酸铵、蛋白胨进行初始发酵培养基最适氮源的筛

选，其余条件不变，发酵５ｄ后，测定酶活性，确定最

佳氮源。

１．２．４．３　ｐＨ值的优化　取最适碳源和氮源，ｐＨ值

分别设为３．５、４．０、４．５、５．０、５．５，其余条件不变，发

酵５ｄ后，测定酶活性，确定最佳ｐＨ值。

１．２．４．４　发酵培养时间的优化　选择优化后的最

佳培养基进行发酵培养，从培养２ｄ开始，每天测定

１次纤维素酶活性，确定最佳培养时间。１．２．４．５　正交优化　依据单因素试验结果，选择碳

源、氮源、ｐＨ值和生长时间，设计４因素４水平正交

试验［１０］，采用Ｌ１６（４４）正交表。

１．２．５　菌种的鉴定

１．２．５．１　形态学的鉴定　将菌种ＴＷ０６３－３活化

后，接１小块菌饼到ＣＹＡ平板上，于２８℃培养３ｄ

产孢后，挑取少量带孢子的菌丝置于载玻片上，显

微观察并拍照。

１．２．５．２　分子生物学鉴定　ＤＮＡ提取参照生工生

物工程（上海）股份有限公司（ＳａｎｇｏｎＢｉｏｔｅｃｈ）

ＤｎｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（５０）的试剂盒。采用真菌

１８ＳｒＤＮＡ通用引物ＩＴＳ１ｆ（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣ

ＴＧＣＧＧ－３′）、ＩＴＳ４Ｒ（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴ

ＧＣ－３′）扩增ＩＴＳ（内转录间隔区）序列，ＰＣＲ扩增程

序：９４℃４ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５７℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，３３

个循环；７２℃１０ｍｉｎ。经生工生物工程（上海）股份

有限公司测序后通过ＭＥＧＡ７构建系统进化树。

２　结果与分析

２．１　高产纤维素酶菌株的筛选

本研究共分离纯化１６４株菌株，通过初筛获得

６株纤维素酶活性最高的菌株（图１）。复筛结果表

明，菌株ＴＷ０６３－３（Ｐ＝８．７３ｅ－１０＜０．０１）的纤维素酶

活性最高，为２６８．２Ｕ／ｍＬ。因此，选取ＴＷ０６３－３进行后续研究。

２．２　高产纤维素酶菌株的分类鉴定

２．２．１　形态学鉴定　菌株活化后接种于ＣＹＡ培养

基上培养３ｄ产孢后，挑取菌丝进行显微观察，结果

见图２。观察发现，菌落呈灰绿色，边缘为白色，多

分生孢分散形成许多小菌落（图２－Ａ）；分生孢子梗多次分枝后出现多簇对称或不对称的小梗，形如

扫帚，具有隔膜且多个分支。分生孢子大多为球形

和椭圆形，生长时为蓝绿色（图２－Ｂ～图２－Ｄ），因

此初步鉴定ＴＷ０６３－３为青霉菌。

２．２．２　分子生物学鉴定　ＴＷ０６３－３序列通过ＮＣＢＩ—５１２—ＢＬＡＳＴ进行序列比对，通过ＭＥＧＡ７的ＮＪ法构建系

统进化树。由图３可以看出，ＴＷ０６３－３与草酸青

霉的同源性都为９９％，可靠性为１００％。综合形态

学鉴定结果，确定ＴＷ０６３－３为草酸青霉（ＮＣＢＩ登

录号：ＭＴ０２０３８５）。

２．３　产酶条件优化

２．３．１　最佳碳源　如图４所示，以羧甲基纤维素钠

（ＣＭＣ－Ｎａ）为碳源时，纤维素酶活性最高，为

３３０１５Ｕ／ｍＬ（Ｐ＝０．０１６７＜０．０５）。而葡萄糖和淀

粉２种碳源产酶活性差异不显著。因此选择羧甲基

纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）作为最佳碳源。

２．３．２　最佳氮源　如图５所示，以硝酸铵为氮源的

酶活性与除蛋白胨外其他３种氮源的差异不显著，

但是其生长量（Ｐ＝０．００４２４＜０．０１）比其他３种氮

源高（图６）。因此，选择硝酸铵作为最佳氮源。

２．３．３　最适ｐＨ值　ｐＨ值为３．５时，酶活性显著

低于其他４种ｐＨ值（Ｐ＝０．０００１５４＜０．０１），ｐＨ值

为４．０的酶活性与ｐＨ值４．５、５．０时差异显著，ｐＨ

值为４．５、５．０、５．５的酶活性差异不显著，其中ｐＨ

值为５．０时酶活性最高。因此，选则ｐＨ值５．０为

产酶的最佳ｐＨ值，酶活性为３００．９Ｕ／ｍＬ（图７）。

２．３．４　最佳培养时间　确定该菌株最佳培养基后，

从培养２ｄ开始，每天测定１次菌株所产纤维素酶活性，培养７ｄ结束。如图８所示，ＴＷ０６３－３菌株

在培养４ｄ时酶活性最高，在培养５ｄ时酶活性下

降，但是培养６ｄ又开始上升，在培养７ｄ开始小幅

度下降。而培养４ｄ与培养６ｄ的酶活性差异不显

著，培养６ｄ与培养３ｄ的酶活性差异不显著，培养

２ｄ与培养７ｄ的酶活性差异不显著，培养４ｄ的酶

活性为３００．４２Ｕ／ｍＬ，高于培养６ｄ的酶活性。因

此，选择培养４ｄ作为ＴＷ０６３－３产纤维素酶的最—６１２—

佳培养时间。

２．３．５　正交优化　依据单因素试验结果，选择羧甲基纤维素钠（Ａ，设５、１０、１５、２０ｇ／Ｌ４个水平）、硝酸

铵（Ｂ，设２、４、６、８ｇ／Ｌ４个水平）、ｐＨ值（Ｃ，设３、４、

５、６４个水平）和培养时间（Ｄ，设３、４、５、６４个水

平）设计４因素４水平正交试验，采用Ｌ１６（４４）型正

交设计。正交试验结果的极差分析表明，影响酶活

性的４个因素排序为培养时间（Ｄ）＞ｐＨ值（Ｃ）＞

碳源（Ａ）＞氮源（Ｂ），对于Ａ因素，由于ｋ３＞ｋ１＞

ｋ４＞ｋ２，所以取Ａ３，同理，Ｂ因素取Ｂ１，Ｃ因素取Ｃ１，

Ｄ因素取Ｄ４，其最优组合为Ａ３Ｂ１Ｃ１Ｄ４（表１），即产

纤维素酶最佳培养基组合为１５ｇ／Ｌ羧甲基纤维素

钠＋２ｇ／Ｌ硝酸铵，ｐＨ值为３．０，培养时间为６ｄ。

由于正交极差分析表中培养组合为Ａ１Ｂ４Ｃ１Ｄ４的酶活性最高，因此选取Ａ１Ｂ４Ｃ１Ｄ４、Ａ３Ｂ１Ｃ１Ｄ４的培

养条件进行验证试验。结果表明，组合Ａ３Ｂ１Ｃ１Ｄ４的培养条件下培养的ＴＷ０６３－３产生的纤维素酶活

性高达５２４．４Ｕ／ｍＬ。由此，确定培养条件的最佳组

合为Ａ３Ｂ１Ｃ１Ｄ４。

３　结论

纤维素是自然界中分布最广、产量最大的多糖

类物质，由于其多糖结合的高聚合性及复杂性，导

致这类最丰富的资源一直无法得到充分开发利用。—７１２—