过氧化物酶封闭液(H2O2法)

TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)产品编号 产品名称包装 C1098TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)50次产品简介：碧云天生产的显色法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。

对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB 显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA 。

细胞凋亡时抽提DNA 进行电泳检测，可以发现180-200bp 的DNA ladder 。

基因组DNA 断裂时，暴露的3'-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP 的催化下通过DAB 显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

本试剂盒有如下优点。

(1) 高灵敏度：背景染色极低，阳性染色强，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA 断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。

(2) 特异性好：TUNEL 检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。

(3) 快速：仅需约2-3个小时即可完成。

(4) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

(5) 实测效果好：参考图1。

图1. 本试剂盒的检测效果图。

A. HeLa 细胞未处理或用DNase I 室温孵育10分钟后的检测效果图。

免疫组化,免疫检测北京华越洋生物-----------------------------------------------DMDC玻片硅化剂(2%) 100ml 免疫组化40% 室温,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由二甲二氯硅烷(DMDC)组成。

玻片硅化试剂盒(APES法) 3×100ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。

玻片硅化试剂盒(APES法) 3×500ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。

PBS-Triton去污剂100ml 免疫组化40% 室温,12个月去污主要由PBS、Triton-100组成。

Sorensen磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH5.3-8.04)500ml 免疫组化40% 4℃,6个月组织化学常用缓冲液主要由磷酸二氢盐(钠/钾)和磷酸氢二盐(钠/钾)溶液组成,按不同比例混合后获得对用PH值。

pH值可选5.3，5.6，5.91，6.24，6.47，6.64，6.81，6.98，7.17，7.73，8.04。

Sorensen磷酸缓冲液(1×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度17mM。

Sorensen磷酸缓冲液(10×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度170mM。

TBS缓冲液(0.02mol/L,pH8.2) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠组成。

TBS缓冲液(0.05mol/L,pH7.4) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠、叠氮钠、BSA组成。

免疫组化
注意：全程不能干片。

1. 石蜡切片，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水。

2. 3% H2O2去离子水室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性（有人也不消除，刚开始做，建议使用）。

PBS冲洗，5min×3 次。

根据需要选择抗原修复方式及强度。

热修复、酶修复或不修复。

3. 热修复抗原：将切片浸入到EDTA 修复液中，微波炉加热到沸腾后断电（不可持续沸腾），间隔10-15min 再修复1-2 次，冷却至室温。

4. 用PBS过度，擦干周围PBS，滴加5% BSA 封闭液37℃孵育30min，甩干，勿洗。

5. 滴加适当稀释的一抗（稀释参考说明书），37℃孵育2 小时或4℃过夜（过夜效果会更好一些）。

PBS 冲洗，5min×3 次。

6. 擦干周围PBS，滴加生物素标记山羊抗大鼠IgG（二抗），37℃孵育30min。

PBS 冲洗，5min×3 次。

7. 滴加SABC，37℃孵育30min。

PBS 冲洗，5min×3 次。

8. 显色：光镜下控制反应时间。

显色剂可选DAB。

自来水背面充分冲洗。

9. 苏木素复染，染色时间为0.5-2min。

梯度酒精脱水，二甲苯透明。

10. 选用中性树胶封片。

过氧化物酶（微量法）试剂盒使用说明货号:BC0095规格:100T/96S产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体×1瓶，4℃保存；用时每瓶加入3mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周。

试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存。

产品简介：POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

POD 催化H 2O 2氧化特定底物，在470nm 有特征光吸收。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3秒，间隔10秒。

重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

二、POD 测定操作表1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至470nm，蒸馏水调零。

2、测定前将试剂一、二和三在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min 以上。

3、样本测定表试剂名称测定孔（μL）样本10蒸馏水60试剂一120试剂二30试剂三30在微量石英比色皿或96孔板中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。

计算ΔA=A2-A1。

注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液，在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min以上，测定时加入240μL混合液和10μL样本测定。

南京森贝伽生物科技有限公司 网址：/第1页 仅供科研版本号：171024过氧化物酶染色液(联苯胺法)【产品组成】【保存条件】4℃,避光 ,6个月【产品概述】过氧化物酶(Peroxidase ，简称POX 或MPO)是由微生物或植物所产生的一类能催化很多反应的以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

过氧化物酶染色液(联苯胺法)是ICSH 推荐采用的POX 染色液，其原理是细胞内的过氧化物酶能将无色的3,3-二氨基联苯胺(DAB)的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色染料沉积在细胞质中的POX 所在部位。

该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片过氧化物酶染色,POX 活性部位呈棕黄色。

【使用方法】1、血液、骨髓或细胞涂片滴加预冷的BFA 固定液，4℃固定30～60s ，稍水洗。

2、滴加配制好的POX 孵育液，室温(20～25℃)避光孵育10～15min ，水洗2min 。

3、滴加WG 染色液，孵育30～60s 。

4、直接滴加等量WGbuffer ，染色10～15min 。

5、水洗、晾干、镜检。

【染色结果】粒细胞系除早期原粒细胞阴性外，分化好的原粒细胞以下阶段细胞随细胞成熟而阳性反应增强，衰老中性粒细胞反应程度减弱单核细胞系弱阳性，淋巴细胞系为阴性。

浆细胞及巨核细胞均为阴性。

嗜酸性粒细胞和Auer 小体呈强阳性反应。

阳性反应强度的判断：【临床意义】1、急性粒细胞白血病晚期的原粒细胞呈阳性，颗粒较少且大。

2、急性单核白血病细胞呈阴性或弱阳性，颗粒小且稀疏。

3、单核急性白血病呈阴性或弱阳性。

4、急性早幼粒白血病呈强阳性，某些早幼粒细胞呈阳性，恶性组织细胞呈阴性。

5、急性淋巴细胞白血病呈阴性。

【注意事项】1、血液或骨髓涂片应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。

2、POX孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。

gsh-px检测原理
GSH-Px（谷胱甘肽过氧化物酶）是一种重要的抗氧化酶，它在
细胞内起着保护细胞免受氧化损伤的作用。

GSH-Px检测原理涉及到
谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢（H2O2）之间的反应。

GSH-Px能够将GSH和H2O2催化反应，将H2O2还原成水，并同时氧化GSH为氧化
谷胱甘肽（GSSG）。

这个反应是细胞内抗氧化防御系统中非常重要
的一环。

在实际的检测中，一般会利用底物和辅酶来检测GSH-Px的活性。

常用的方法包括直接测定底物消耗法、间接法和光度法。

其中，直
接测定底物消耗法是通过测定反应体系中底物消耗的速率来判断
GSH-Px的活性，间接法是通过测定GSH的浓度变化来间接测定GSH-Px的活性，而光度法则是通过测定反应体系中H2O2浓度的变化来
判断GSH-Px的活性。

总的来说，GSH-Px检测的原理是基于其催化还原过氧化氢的能力，通过测定反应体系中底物消耗、GSH浓度变化或H2O2浓度变化
来间接或直接地测定GSH-Px的活性。

这些方法可以帮助科研人员和
临床医生评估细胞的抗氧化能力和氧化应激状态，从而为疾病的诊
断和治疗提供重要的参考依据。

过氧化物酶染色液（DAB法）使用说明书过氧化物酶染色液(DAB法)使用说明书货号：G2370有效期：6个月有效。

产品内容：名称4×10ml4×20ml Storage 试剂(A):BFA固定液10ml20ml4℃避光试剂(B): POX孵育液B1:DAB染色液10ml20ml-20℃避光B2:DAB氧化剂2×100μl4×100μl RT临用前，按B1:B2=1000:1比例混合，即为POX孵育液，即配即用。

试剂(C):WG染色液10ml20ml RT避光试剂(D):WG buffer10ml20ml RT产品说明：过氧化物酶(Peroxidase，简称POX或MPO)是由微生物或植物所产生的一类能催化很多反应的以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

过氧化物酶染色液(DAB法)是ICSH推荐采用的POX染色液，其原理是细胞内的过氧化物酶能将无色的DAB的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色染料沉积在细胞质中的POX所在部位。

该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片过氧化物酶染色,POX活性部位呈棕黄色。

自备材料：1、载玻片2、显微镜操作步骤(仅供参考)：1、血液、骨髓或细胞涂片滴加预冷的BFA固定液，4℃固定30～60s，稍水洗。

2、滴加配制好的POX孵育液，室温(20～25℃)避光孵育10～15min，水洗2min。

3、滴加WG染色液，孵育30～60s。

4、直接滴加等量WG buffer，染色10～15min。

5、水洗、晾干、镜检。

染色结果：POX活性部位棕黄色细胞核蓝色粒细胞系除早期原粒细胞阴性外，分化好的原粒细胞以下阶段细胞随细胞成熟而阳性反应增强，衰老中性粒细胞反应程度减弱单核细胞系弱阳性，淋巴细胞系为阴性。

浆细胞及巨核细胞均为阴性。

Western blot发光检测中常见的问题及解决方法免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。

其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。

众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。

拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。

在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。

Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。

大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。

ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。

ECL 法具有灵敏度高，线性范围广等特点。

图1 ECL检测原理图Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。

现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：1.目的蛋白信号弱或无。

在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。

首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。

北京雷根生物技术有限公司
过氧化物酶封闭液(H 2O 2法)
简介：
在免疫组化染色中，如果组织内存在相同的内源酶，应抑制内源性酶活性，不能让其加入底物的反应体系，以免影响标记的效果。

过氧化物酶反应的最佳pH 值是5，但pH=5.0时反应产物常常比较粗糙，因此在免疫组化染色中常使用pH6.0～7.6以延缓反应，使反应产物颗粒变小。

在免疫组化染色前需要抑制内源性过氧化物酶的活性，以便去除非特异性结合反应。

Leagene 过氧化物酶封闭液(H 2O 2法)由低浓度H 2O 2、磷酸盐等组成，能够很好的非特异性结合反应，尤其适用于封闭内源性过氧化物酶的活性。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 切片贴于玻片上，用PBS 轻轻清洗。

2、 将玻片吸干或吹干，入过氧化物酶封闭液，孵育。

3、 无需清洗，直接将玻片吸干或吹干。

4、 在未标记的一抗中孵育。

注意事项：
1、 一经开启，立即使用，防止有效成分挥发。

2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

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