当前位置：文档之家 › 考马斯亮蓝法——完整版PPT课件

考马斯亮蓝法——完整版PPT课件

  • 格式：ppt
  • 大小：408.00 KB
  • 文档页数：10

下载文档原格式

  / 10

合集下载

考马斯亮蓝法完整版

考马斯亮蓝法完整版
天津医科大学药学院《体内药物分析》第三章——
考马斯亮蓝法（Bradford法）
徐亮
xuliang@
Tianjin Medical University
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
四、Bradford法的优缺点
1、优点
（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光 系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为 1ug蛋白质。
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只 需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
（3）干扰物质少。
四、Bradford法的优缺点
2、缺点
用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料
与蛋白质结合时， 其 max 由 465nm 变为595nm
强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器

实验8考马斯亮蓝法测蛋白质的含量

实验8考马斯亮蓝法测蛋白质的含量

对实验条件进行优化，如调整PH值、反应时间、温度等，以提高实验
结果的稳定性。
03
应用拓展
进一步研究考马斯亮蓝法在特殊蛋白质或不同来源蛋白质测定中的应用，
拓展其应用范围。同时，可以探索与其他蛋白质测定方法的比较研究，
为蛋白质定量分析提供更多选择。
THANKS
[ 感谢观看 ]
标准曲线的绘制
加样
将标准蛋白溶液分 别加入相应的试管 中。
测定光密度值
在特定波长下测定 各试管的光密度值， 记录数据。
准备标准蛋白溶液
制备一系列不同浓 度的标准蛋白溶液。
显色反应
向每个试管中加入 适量的考马斯亮蓝 溶液，混合均匀。
绘制标准曲线
根据测得的光密度 值与标准蛋白浓度 绘制标准曲线。
加样
样品稀释
根据实验需求，将蛋白质 样品进行适当稀释，以便 后续测量。
样品标记
对每个样品进行标记，以 便后续结果分析时能够准 确对应。
考马斯亮蓝溶液的配制
准备试剂
储存与使用
按照实验要求准备考马斯亮蓝溶液所 需的试剂。
将配制好的考马斯亮蓝溶液储存于棕 色瓶中，避免光照，使用前摇匀。
配制溶液
将各试剂按比例混合，制备出考马斯 亮蓝溶液。
影响因素
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，PH值、反应时间、温度等因素 可能影响实验结果。
适用范围
考马斯亮蓝法适用于大多数蛋白质的定量测定，但对于某些特殊蛋 白质或不同来源的蛋白质可能存在一定误差。
对实验的改进建议与展望
01
标准化操作
为提高实验准确性，建议对实验操作进行标准化，减少人为误差。
02
优化条件
考马斯亮蓝与蛋白质结合的机制

考马斯亮蓝法显示细胞中的微丝课件

考马斯亮蓝法显示细胞中的微丝课件
考马斯亮蓝法显示 细胞中的微丝课件
目录
• 引言 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 结论 • 注意事项与局限性 • 参考文献
01
引言
微丝简介
微丝是一种由肌动蛋白聚合形成的纤维 状蛋白质结构，是细胞骨架的重要组成 部分。它们在细胞形态维持、细胞运动 、物质运输等许多细胞活动中发挥关键
作用。
样品制备
将培养的细胞进行固定，常用的 固定剂包括甲醇和冰醋酸，固定 后使用适宜的缓冲液洗涤细胞。
考马斯亮蓝染色
染色液配制
洗涤
将考马斯亮蓝加入适量的甲醇溶液中 ，搅拌均匀后过滤，得到染色液。
染色完成后，使用缓冲液洗涤细胞样 品，去除多余的染色液。
染色过程
将固定和洗涤后的细胞样品加入染色 液中，染色时间根据实验需求而定， 一般为10-30分钟。
通过对染色结果的观察和分析， 发现微丝在细胞中的分布和形态 具有组织特异性，与细胞的生理
功能密切相关。
对未来研究的建议
进一步探讨考马斯亮蓝法染色显示细 胞中微丝的机制，以及染色效果的影 响因素，为该方法的优化和应用提供 理论依据。
深入研究微丝在细胞中的功能和作用 机制，以期为相关疾病的治疗和药物 研发提供新的思路和靶点。
考马斯亮蓝法只能显示细胞中已经存在的微丝，无法检测细胞中微丝的 动态变化。
由于染色过程较为复杂，可能会影响细胞活性，导致实验结果不准确。
该方法无法区分不同类型的微丝，只能显示微丝的总量。
07
参考文献
参考文献
[2] Wang Y, Li Z. Application of Coomassie brilliant blue staining in cytoskeleton research[J]. Journal of Cell Biology, 2019, 215(3): 289-298.

蛋白质含量测定-考马斯亮蓝法ppt课件

蛋白质含量测定-考马斯亮蓝法ppt课件

Amax = 595nm
5
精品课件
Bradford 法的突出特点:
(1)灵敏度高。其最低检测蛋白质含量可达1mg， 这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜 色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的 吸光系数。
(2)测定快速，简洁，完成一个样品的测定， 只要5分钟左右 。染料与蛋白质结合的过 程，大约只要2分钟,其颜色在1小时内保持 稳定（在5-20分钟之间，稳定性最好）
Folin—酚试剂法（Lowry法） Folin—酚试剂 中的磷钼酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸 残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合 物），在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量 成正比。该法的灵敏度是双缩脲法的100倍.
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法:染料
主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨
精品课件
14
完成了散点图，现在需要根据数据进行回归 分析，计算回归方程，绘制出标准曲线。其 实这很简单，先点击图上的标准值点，然后 按右键，点击“添加趋势线”。
点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然 后按右键，选趋势线格式，
在显示公式和显示R平方值（直线相关系数） 前点一下，勾上。再点确定。公式和相关系 数都出来了 。
酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下
测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比，灵敏
度高比Lowry法约高四精品课倍件
3
实验原理
1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法，是 根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种 方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一.
考马斯亮蓝G-250染料，在游离状态下呈棕红 色，在酸性溶液中当它与蛋白质结合后，变为 蓝色，使染料最大吸收峰位置，由465nm变为 595nm。

蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝染色法(共20张PPT)

蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝染色法(共20张PPT)

光源
0.575
单色器
吸收池
检测器 显示器
第6页，共20页。
➢ 光源
不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源
钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的320～1100nm波长的光谱，光通过三棱镜折射
后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为 可见光分光光度计的光源
吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质 Ø当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射，一 部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液，则：
入射光=反射光+吸收光+透过光
Ø如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射等因素造成的入射光 的损失，则：
入射光=吸收光+透过光
第4页，共20页。
Ø朗伯-比尔（Lambert-Beer）光吸收定律
u设 I0为经过空白校正后入射光的强度，I t为透过光的强度 u根据实验得知：It= I0 ·10－εbc，式中：c 表示吸收物质的摩尔浓度；b表示吸收物质的光径， 用cm表示；ε表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物 质的ε数值不同，所以 It/ I0= 10－εbc u令 T（透射比）= It/ I 0 ， 则T=10－εbc ，lg（1 / T）=εbc ulg（l / T）为物质的吸光度（A），则A = 1g（1 / T）＝εbc，此式说明了物质的吸光度 与吸收物质的浓度和光程成正比，这就是Lambert-Beer光吸收定律
蛋白质含量的测定 考马斯亮光光度技术的一般原理
ü学习722型可见光分光光度计的操作 ü熟悉考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法

《生物化学实验》教学课件—14 蛋白质的定量测定-考马斯亮蓝染色法

《生物化学实验》教学课件—14 蛋白质的定量测定-考马斯亮蓝染色法
生物化学实验技术
生物化学实验技术
A595
牛血清白蛋白标准曲线图
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 标准蛋白质质量（mg）
标准蛋白
生物化学实验技术
2、样品测定：取试管三支，吸取上述样品提 取液0.1mL，加入考马斯亮蓝G250，3.0mL， 充分震荡混合，放置五分钟，以1号试管为空 白对照，于595nm测定吸光度，在标准曲线上 查出其相当于标准蛋白的量。 3、计算样品中蛋白质含量。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、材料：稀释40倍的纯牛奶 2、器材：721分光光度计、试管、试管架、 移液管。 3、试剂：考马斯亮蓝G250，0.9%生理盐 水，蛋白质标准溶液（1mg/mL）。
生物化学实验技术
四、实验内容
1、标准曲线的制作：取试管6支，按下表编号 并加入试剂6
V标准蛋白质溶液（μL）
0 20 40 60 80 100
V0.9%生理盐水（μL）
100 80 60 40 20 0
ρ（蛋白质含量）μg/mL
0 20 40 60 80 100
生物化学实验技术
分别向每支试管中加入考马斯亮蓝G250 试剂3.0mL，充分震荡，放置五分钟，于 595nm测定吸光度，以1号试管为空白对照， 以A595为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标， 绘制标准曲线。
生物化学实验技术
蛋白质的定量测定—— 考马斯亮蓝染色法
实验类型：综合性 教学时数：6
一、实验目的
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原 理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。
生物化学实验技术
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
天津医科大学药学院《体内药物分析》第三章——
考马斯亮蓝法（Bradford法）
徐亮
xuliang@
Tianjin Medical University
1
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、 30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离）
硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷酸
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
用于标准蛋白Hale Waihona Puke 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长
用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似
4
2、样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的
待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
5
四、Bradford法的优缺点
1、优点
（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光 系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug 蛋白质。 （2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只 需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
（3）干扰物质少。
6
四、Bradford法的优缺点
2、缺点
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏 差，在制作标准曲线时最好选用 γ—球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有： 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的 NaOH
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进 行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
7
五、注意事项
1、 如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光 吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
2、 若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产 生大量气泡而难于消除。
8
2
二、试剂与器材
1. 试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%
H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含 0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇， 8.5%（W/V）H3PO4。
六、思考题 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的方
法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有何 优缺点？
9
五种蛋白质测定方法比较如下：
方法
灵敏度
时间
原理
干扰物质
说明
凯氏定氮法 （Kjedahl法）
双缩脲法 （Biuret法）
灵敏度低，适 用 于 0.2~ 1.0mg 氮 ， 误 差为 2％
灵敏度低 1～20mg
最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜 色 深 浅 随10不 同
紫外吸收法
较为灵敏 50～100g
Folin－酚试剂 灵敏度高 法 （ Lowry 法 ） ～5g
费时 8～10小 时
中速 20~30 分 钟
快速 5～10分 钟
慢速 40～60 分钟
将蛋白氮转化为 氨，用酸吸收后 滴定
多肽键＋碱性Cu2 ＋紫色络合物
蛋白质中的酪氨 酸和色氨酸残基 在 280nm 处 的 光 吸收
（2）标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100
ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器
3
三、操作方法
1、标准曲线的制作
试管编号
0123456
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料
与蛋白质结合时， 其 max 由 465nm 变为595nm
强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS